CMV 啟動子克隆及其在植物體內的表達

于秀敏，岳文冉，王瑞剛

（內蒙古農業大學 生命科學學院，內蒙古 呼和浩特 010018）

植物基因工程已取得較大進展，但能用于植物基因工程的啟動元件還非常有限.CaMV 35S啟動子是目前植物基因工程中使用最為廣泛的啟動子［1－4］.然而，近年來有關啟動子特別是35S啟動子引發的轉基因沉默的報道越來越多［1，5］.不僅如此，35S啟動子的可調控性也不高，不利于外源基因表達的有效調控［6］.而且，它在單子葉植物中的表達強度也比較低［7－8］.因此，尋找新的啟動子或改良現有啟動子以便植物基因工程有更多的基因調控系統已成為當前植物基因工程研究的熱點.

細胞肥大病毒（cytomegalo virus）CMV 啟動子和35S啟動子均為病毒來源的啟動元件，基因結構較小，并具有較高的表達強度［9－10］.由此推測CMV 啟動子具有與35S啟動子相似的表達特性，即可能具有在植物表達的特性.本文通過CMV 啟動子指導的GUS intron基因在煙草葉組織內的瞬時表達，試圖探討該啟動子在植物體內的表達特性和應用于植物基因工程的可能性.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料

野生型煙草（Nicotiana tabacum）品種：革新一號.本實驗使用6～12周齡煙草的完全展開葉片.

1.1.2 用于PCR 克隆的引物與模板

用于CMV 啟動子PCR 克隆的引物為

由INTEGRATED DNA TECHNOLOGIES，INC公司合成.模板為pcDNA3.1－Myc－His－A（5523bp）.

1.1.3 菌株、質粒及試劑

大腸桿菌DH5α，農桿菌LBA4404（Rifr，Strr），中間載體PUC19／2×35S－GUS，pGPTV－Kan由本實驗室提供.實驗所用PCR Product Cleaning Up Kit，DNA Gel Extraction Kit以及Plasmid Miniprep Kit購自Qiaen Inc.USA.Taq DNA Polymerase 購自TaKaRa 公司，限制性內切酶BglⅡ，HindⅢ，EcoRⅠ和T4DNA Polymerase購自Fermentas公司，其他化學試劑均為國產或進口分析純.

1.2 方法

1.2.1 CMV 啟動子的克隆

分別以1.1.2所述PCR 引物及模板進行PCR 擴增.PCR 反應體系參見Taq DNA Polymerase說明書.PCR 反應程序為94℃預變性1min，94℃變性1min，55℃退火1min，68 ℃延伸3min，30個循環；68℃延伸7min.PCR 產物經質量濃度為10g／L的瓊脂糖凝膠電泳分離后，并經DNA Gel Extraction Kit純化收集，4 ℃臨時保存備用（或－20 ℃凍存）.

1.2.2 CMV 啟動子與PUC19／2×35S－GUS重組載體的構建

分別用BglⅡ和HindⅢ雙酶切CMV 啟動子的PCR 克隆產物和植物表達載體PUC19／2×35S－GUS，質量濃度為10g／L的瓊脂糖凝膠電泳分離CMV 啟動子的PCR 酶切產物的700（714）bp左右的片段以及載體PUC19／2×35S－GUS酶切產物中的大片段.用DNA Gel Extraction Kit回收目的基因片段和載體大片段，將2片段用T4DNA Polymerase進行連接，然后轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，將菌液涂于抗性篩選（Amp，100mg／L）的LB平板上，篩選重組表達載體PUC19／CMV－GUS intron.菌落PCR 初步鑒定后，小量提取質粒進行BglⅡ和HindⅢ雙酶切鑒定，得到正確的重組表達載體PUC19／CMV－GUS intron，標記為PCG.

1.2.3 重組質粒PUC19／CMV－GUS intron與載體pGPTV－Kan的重組

用HindⅢ和EcoRⅠ對PUC19／CMV－GUS intron質粒DNA 和中間載體pGPTV－Kan質粒DNA 進行雙酶切，經10g／L 的瓊脂糖凝膠電泳分離PUC19／CMV－GUS intron的2.9kb和pGPTV－Kan的酶切大片段，并用DNA Gel Extraction Kit回收片段.將2片段用T4DNA Polymerase進行連接，然后轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，雙抗性（40mg／L Rif＋100mg／L Kan）LB 平板篩選重組表達載體pGPTV－Kan／CMV－GUS intron，標記為LpPCG，挑取陽性克隆進行菌落PCR 初步鑒定，小量提取質粒進行HindⅢ和EcoRⅠ雙酶切鑒定.同時將pGPTV－Kan質粒DNA 轉入大腸桿菌DH5α，獲得pGPTV－Kan中間載體，標記為LpGPTV.

1.2.4 農桿菌植物組織滲入與瞬時性表達

用電轉化法將以上2種重組質粒轉化農桿菌LBA4404，挑取陽性克隆，進行PCR 鑒定.獲得植物表達載體LpPCG 和LpGPTV.選擇完整的位于植株中部偏上的完全展開葉片，用1mL 塑料注射器將農桿菌懸浮液從葉背注入細胞間隙，滲入組織位于葉主脈及2排次脈之間，面積約4cm2左右，滲入農桿菌懸浮液量為100μL.每個葉片以葉脈分隔，滲入8～16點，于室內22～25 ℃，16／8h光暗條件下培養48h.

1.3 熒光法GUS活性檢測

將含有滲透位點的葉組織片收集到1.5mL的Eppendorf管中，加入500μL的GUS提取液，液氮冷凍后冰浴下研磨.4 ℃離心10min，取出50μL上清液加入250μL 的GUS檢測溶液和200μL GUS提取液.立刻從混合液中移出另一個50μL 的等分試樣，加入2mL 的終止液用做對照.其余的混合物37 ℃保溫60min.用50mmol／L，pH7.0的磷酸鈉緩沖液沖洗3次，按熒光檢測法檢測GUS表達活性.

1.4 數據處理

采用EXCEL2003系統進行作圖及統計分析.

2 結果分析

根據CMV 啟動子設計了其PCR 克隆引物，高保真PCR 克隆CMV 啟動子，利用其與中間載體PUC19／2×35S－GUS和pGPTV－Kan的重組中分別獲得其與GUS intron和NPTⅡ基因的融合，從而得到具有Kan抗性的表達載體.

2.1 CMV啟動子的克隆

PCR 擴增CMV 啟動子，得到大小在0.7kb左右的PCR 產物（圖1），其長度與實驗設計的CMV 啟動子的714bp的序列長度接近.推測該PCR 產物是CMV 啟動子.

2.2 重組質粒PUC19／M15K－GUS intron的構建及其鑒定

利用CMV 啟動子PCR 產物酶切片段，與中間載體PUC19／2×35S－GUS的重組，得到了PCG 重組子，其PCR 檢測結果（圖2）與上述結果一致.BamHⅠ＋HindⅢ雙酶切和HindⅢ＋EcoRⅠ雙酶切的檢測結果（表1，圖3）表明，重組表達載體PUC19／CMV－GUS intron構建正確.

圖1 CMV啟動子的PCR 克隆結果Fig.1 PCR amplification of CMV promoter gene

圖2 PCG 重組子PCR 檢測結果Fig.2 PCR amplification of the PCG recombinant plasmids

圖3 PCG 重組子酶切檢測結果Fig.3 Electrophoretic analysis of PCG recombinant plasmids after digestion with restriction enzymes

表1 PCG 重組子BamHⅠ＋HindⅢ和HindⅢ＋EcoRⅠ雙酶切理論大小Tab.1 Theoretical size of PCG recombinant plasmids after digestion with double restriction enzymes.

PCG 的HindⅢ、EcoRⅠ雙酶切片段CMV－GUS與pGPTV－Kan重組子pPCG 檢測結果也得到與圖3相似的CMV 啟動子擴增條帶.其BamHⅠ＋EcoRⅠ雙酶切和HindⅢ＋EcoRⅠ雙酶切的檢測結果（表2，圖4）證實該重組子是正確的.

圖4 pPCG 質粒DNA酶切檢測結果Fig.4 Electrophoretic analysis of pPCG recombinant plasmids after digestion with restriction enzymes

表2 pPCG 重組子BamHⅠ＋EcoRⅠ和HindⅢ＋EcoRⅠ雙酶切理論大小Tab.2 Theoretical size of pPCG recombinant plasmids after digestion with double restriction enzymes

2.3 CMV啟動子在植物體內的瞬時性表達

利用熒光法檢測了CMV 和2×35S啟動子指導的GUS基因在煙草葉組織中的瞬時表達活性.結果表明（圖5），CMV 和2×35S啟動子均可指導GUS基因的瞬時性表達.同時發現，CMV 啟動子的表達活性達到2×35S啟動子的（80.4±26.6）%（n＝6）.

圖5 CMV啟動子指導的GUS瞬時表達活性Fig.5 Transient expression activity of GUS driven by CMV promoter

3 結論

3.1 CMV啟動子在植物體內的瞬時性表達

瞬時表達系統是研究啟動子功能及活性的重要手段之一.由于瞬時性表達的外源基因在受體植物細胞內是游離于染色體之外的，因此，其表達受受體植物基因組的影響相對較小，其啟動子活性基本反映了啟動子本身的表達特性［11－12］.同時，利用瞬時性表達系統可以定性和定量地研究啟動子的表達活性.通過熒光檢測法，CMV 啟動子可指導GUS基因的瞬時性表達.

3.2 CMV啟動子在植物基因工程中的潛在應用價值

前人對35S啟動子的研究結果表明，35S啟動子存在2個重要區域，即從－90至＋8的A 區和－343至－90的B區.其A 區主要負責在胚根、胚乳及根組織中表達；而B區則主要控制胚、子葉及成熟植株的葉組織及維管組織內的表達［2］.Benfey等利用UidA 基因證實了35S的－90至－46區域和－343至－90區域分別是在根部和葉部表達所必需的［13］.有人將35S的－343至－90區域作順向重復排列構成了增強型35S雙啟動子（2×35S），并證明其表達活性顯著增強.另外，郝林等的研究證明2×35S啟動子在擬南芥中的表達水平比35S啟動子高出11倍［1］.筆者的上述實驗結果表明，CMV 啟動子均具有相當于2×35S啟動子80%左右的活性，這說明，CMV 啟動子在植物體內具有較高的表達活性.這一結果表明，CMV 啟動子可能為植物基因工程中表達外源基因提供新的啟動子選擇，也就是說CMV啟動子在植物基因工程中具有潛在的應用價值.

由于CMV 啟動子是動物基因工程中的啟動元件，因此，這一實驗結果表明，某些動物來源的啟動子也同時具有植物表達活性.也就是說動植物啟動子在基因表達調控機制上存在著共同之處.早先把果蠅HSP70啟動子具有植物表達活性作為例外［14］，從筆者的上述研究結果看，HSP70啟動子的植物表達活性可能并非例外.實際上，已有結果表明，CaMV 35S啟動子在非洲爪蟾（Xenopus oocytes）和HeLa細胞內的作用與CMV 啟動子一致，表現出較高的表達活性［15－16］.這些結果同時說明，過去認為動物啟動子不被植物所識別的觀點應當改變［2］.

植物與動物同屬于高等真核生物，在基因結構、組成及表達調控方面存在諸多相似之處，如基因的不連續性、高度重復性以及相似的加工、修飾機制.上述結果說明了動植物基因啟動子的調控機制有其同源性，因此，在基因調控水平上研究和尋找動、植物基因的通用性，無論在基礎理論上還是在應用上都具有重要意義.

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