化合物MDPE的抗腫瘤活性

李海晶，楊春柳，張曉旭，路愜楠，楊更亮

（河北大學 藥學院，河北省藥物質量分析控制重點實驗室，河北 保定 071002）

腫瘤是由組織的細胞或變異細胞克隆性異常增殖而形成的，臨床上將腫瘤分為良性和惡性兩大類，其中惡性腫瘤又被稱為癌癥.癌癥是一類嚴重威脅人類健康和生命的疾病［1］，隨著人類生存環境的不斷惡化，癌癥的發病率出現逐年增高的趨勢.據世界衛生組織（WHO）估計，到2030年，癌癥的發病率將達1 320萬人［2］.目前，化療仍是治療惡性腫瘤的主要手段，其中化療藥物的作用機制一般包括4種：干擾核酸的合成代謝，直接與DNA作用干擾其復制、抑制細胞有絲分裂、抑制蛋白質的合成，雖然化療藥物對腫瘤有一定的抑制作用，但副作用也很大，如白細胞增殖、骨髓抑制、惡心、嘔吐等，嚴重影響到病人的生存質量.因此，開發研究能夠提高療效、減輕毒副作用的抗腫瘤藥物已成為一個新的發展趨勢［3］.

硫色滿酮類化合物是一類高脂溶性、低水溶性且含有硫原子的雜環化合物.目前對硫色滿酮類化合物的研究已經成為一個熱點.Mark［4］指出，大多數3位取代硫色滿酮類化合物的生物活性更高.方林等人［5］合成的3－取代硫色滿酮衍生物和Biswanath等人［6］合成的3－芐基－硫色滿酮化合物，均具有不同程度的抗菌活性.劉玉欣等人［7－8］研究了（順）－3－（氯代亞甲基）－6－甲基－硫色酮－4－酮的體外抗腫瘤活性，能夠明顯抑制腫瘤細胞的生長，抗腫瘤活性優于順鉑.同時還研究了另外2種3位取代的硫色滿酮類化合物的體外抗腫瘤活性及其機制，實驗結果表明，這2種化合物均具有較廣泛分體外抗腫瘤活性，可以作為抗腫瘤藥物的先導化合物.本實驗室［9］先前合成的化合物順－6－氟－3－氯代亞甲基－硫色滿－4酮可以顯著抑制H22小鼠皮下移植瘤的生長，并延長S180腹水瘤小鼠的存活時間.

吡唑啉是重要的藥物中間體［10－11］，其衍生物具有廣泛的生物活性，如抗菌和抗腫瘤等［12］.鄒敏等人合成了新的吡唑啉酮類化合物，生物活性測試表明，其中間體和目標產物都表現出很好的抑菌活性［13］.

3位取代的硫色滿酮類化合物生物活性更好，并且吡唑啉類衍生物也具有抗腫瘤效果，所以本實驗室以取代苯硫酚為起始材料，在3位引入吡唑啉類取代基，合成了一種新的化合物2，3，3a，4－二氫硫色并［4，3－c］吡唑啉（MDPE），結構式如圖1.本文對MDPE 的體外和體內的抗腫瘤活性進行了研究.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品與試劑

MDPE固體分散劑由本實驗室合成；注射用順鉑（齊魯制藥有限公司，批號：712058CF），用生理鹽水制成1g／L，原液保存于4 ℃冰箱中，用前稀釋至0.1g／L；RPM1－1640（北京索萊寶科技有限公司）；二甲基亞砜（DMSO，ACS Grade，北京索萊寶科技有限公司）；3－（4，5－二甲基噻唑－2）－2，5 二苯基四氮唑溴鹽（MTT，美國Amersco公司）；肝素鈉（天津生物化學制藥有限公司）；磷酸緩沖液（PBS）由本實驗室配制.

1.1.2 實驗動物及瘤株

昆明種小鼠18～22g，雌雄各半，由河北醫科大學實驗動物中心提供（合格證號：1212021）.實驗前在室溫18.5～22 ℃、相對濕度47%～60%環境中飼養1周.

人胃癌細胞（SGC7901），人肺癌細胞（A549），人宮頸癌細胞（Hela），人肝癌細胞（HepG2），小鼠肝癌細胞（H22）和小鼠肉瘤細胞（S180）均引自中國科學院細胞所.

1.2 方法

1.2.1 MTT 比色法

SGC7901，A549，Hela，HepG2，H22和S180細胞培養于RPMI－1640培養液中（含10%滅活胎牛血清、100 U／mL青霉素、100μg／mL鏈霉素、50μmol／L 2－巰基乙醇、1mmol／L丙酮酸鈉），并將細胞置于37℃，體積分數5%CO2，飽和濕度的CO2培養箱中培養.取對數生長期細胞，用PBS清洗，胰蛋白酶消化并離心.調整細胞濃度為105／mL，接種于96孔板，每孔加100μL，放入CO2培養箱中繼續培養.12h后加入MDPE，使其終質量濃度為分別為0，1.0，5.0，10.0，20.0，40.0μg／mL.陽性對照藥物順鉑的終質量濃度為10μg／mL.24h后，加入5mg／mL的MTT 溶液20μL，繼續培養4h，然后加入150μL的DMSO.隨后，用酶標儀檢測570nm 處的光密度值（OD 值），計算IC50.

1.2.2 MDPE對H22肝癌細胞小鼠皮下移植腫瘤的抑制作用

H22肝癌細胞在小鼠腹腔內傳代7d，于無菌條件下取出腹水，經離心得下層細胞沉淀，經臺盼藍染色計數后，活細胞數大于98%，然后用生理鹽水調整細胞濃度至2×107／mL，取0.2mL細胞懸液接種于小鼠腋部皮下.隨機分為5組，接種腫瘤24h后開始給藥.

1）陰性對照組（n＝12）空白溶劑，按體重灌胃給藥，連續10d.

2）陽性對照組（n＝12）每天1mg／kg，按體重腹腔注射給藥，連續10d.

3）MDPE（每天1mg／kg）（n＝12），按體重灌胃給藥，連續10d.

4）MDPE（每天5mg／kg）（n＝12），按體重灌胃給藥，連續10d.

5）MDPE（每天10mg／kg）（n＝12），按體重灌胃給藥，連續10d.

每天用游標卡尺測量腫瘤的長短徑，按公式1／2（ab2）（a、b分別為腫瘤的長短徑）計算腫瘤體積，繪制腫瘤生長曲線［12］.末次給藥24h后，處死各組小鼠，剝離腫瘤塊，稱取腫瘤質量，計算腫瘤抑制率：腫瘤生長抑制率＝（陰性對照組腫瘤質量－用藥組腫瘤質量）／陰性對照組腫瘤質量×100%.

1.2.3 MDPE對H22肝癌細胞皮下移植瘤小鼠免疫系統的影響

末次給藥后24h，眼瞼取血測定外周血白細胞數.處死各組小鼠、稱重、完整剝離腫瘤后，剪開胸骨，于心臟上方完整摘取2葉胸腺；剪開腹部，于左上腹取脾臟并將脾臟系膜剝離掉用濾紙將表面的組織液吸干后，稱濕重，按以下公式計算胸腺指數和脾臟指數，評價其對免疫系統的作用

臟器指數＝（臟器重量／體重）×100%.

1.2.4 MDPE對H22肝癌細胞皮下移植瘤小鼠骨髓的影響

待小鼠內臟摘取完畢后，剝離股骨，取小鼠完整右側股骨，用7號針在股骨膝關節端打一小孔，抽取3%冰醋酸溶液反復沖洗其骨髓細胞于10mL冰醋酸溶液內，4號針頭過濾，充分混勻并計數.

取左側股骨，用7號針頭在股骨膝關節端打一小孔，用0.005mol／mL CaCl210mL 反復沖洗將骨髓沖入離心管中，于4°C保存.2 500r／min離心15min，棄上清液，將沉淀物加0.2mol／mL HClO45mL充分混勻，90°C加熱15min，冷卻，在260nm 處測定紫外吸收值A.按以下公式計算骨髓DNA 抑制率：

抑制率＝（1－用藥組平均A 值／陰性對照組平均A 值）×100%.

1.2.5 MDPE對S180腹水瘤小鼠生命延長率的影響

無菌條件下，取腹腔內傳代7d的S180肉瘤細胞，2 000r／min離心5min，棄上清液，下層沉淀物用生理鹽水按1:3的體積比例稀釋搖勻，經臺盼藍染色計數，活細胞數大于98%，并調整細胞數至2×107／mL，取0.2mL細胞懸液，接種于每只小鼠腹腔內.

小鼠接種腫瘤24h后，隨機分為陰性對照組和MDPE不同劑量的給藥組，每組12只，雌雄各半.

小鼠接種腫瘤24h后灌胃給藥，MDPE給藥組，劑量分別為每天1，5，10mg／kg；陰性對照組給予相同體積的空白溶劑.每天給藥1次，連續給藥10d.每天記錄小鼠的死亡情況（小鼠存活超過30d按3d算），且按以下公式計算小鼠生命延長率：

生命延長率＝（用藥組平均生存時間／陰性對照組平均生存時間－1）×100%.

1.3 數據統計

因SPSS 17.0軟件對所有數據進行統計學處理，實驗數據均以均數±標準差表示，且各組均數的比較采用單因素方差分析（One－Way ANOVA）.

2 結果與討論

2.1 MDPE的體外抗腫瘤活性

在體外實驗中，MDPE對SGC7901，A549，Hela，HepG2，H22和S180細胞生長的抑制作用如圖2，以直線回歸方法得IC50分別為8.44，8.91，7.30，11.04，7.08和6.93μg／mL.結果顯示：MDPE的抗腫瘤活性明顯高于同濃度的順鉑，且隨著給藥濃度的增加，對腫瘤的生長抑制率也在增加.這說明MDPE 抗腫瘤活性高，也為體內抗腫瘤實驗的研究提供了一定的依據.綜合體外實驗結果，選擇H22和S1802種細胞進行體內實驗研究.

圖2 MDPE對SGC7901，A549，Hela，HepG2，H22and S180細胞的生長抑制率Fig.2 Growth inhibition rates of MDPE on SGC7901，A549，Hela，HepG2，H22and S180cells

2.2 MDPE對H22肝癌細胞小鼠皮下移植瘤的影響

圖3 H22皮下移植瘤的生長曲線Fig.3 Growth curves of H22transplanted subcutaneously models

MDPE 對H22肝癌細胞小鼠皮下移植瘤的抑制作用如圖3和表1.由圖3可知，隨著給藥劑量的增加，MDPE 對腫瘤生長的抑制效果相應的增強，表現出一定的量效關系.MDPE（每天給藥1，5，10mg／kg）3個給藥組的腫瘤生長速度均小于陰性對照組和陽性對照組，表明MDPE 對H22肝癌細胞皮下移植瘤的生長有抑制作用，并且對腫瘤生長的抑制作用優于順鉑.由表1可知，隨著給藥劑量的增加，MDPE對H22肝癌細胞小鼠皮下移植瘤的抑制率也相應的增加，呈現一定的量效關系.MDPE（每天給藥1，5，10mg／kg）3個給藥組的腫瘤抑制率分別為45.33%，50.16%，51.73%，腫瘤抑制效果優于陽性對照組（40.47%）.由腫瘤生長曲線以及腫瘤抑制率來看，MDPE可以抑制腫瘤細胞的生長，推測它可能是通過抑制腫瘤細胞增殖，促進腫瘤細胞凋亡，進而發揮腫瘤抑制作用，其抗腫瘤機制有待進一步研究.

表1 MDPE對H22肝癌細胞小鼠皮下移植瘤的抑制Tab.1 Inhibition of mice implanted tumor H22of MDPE

2.3 MDPE對H22肝癌細胞皮下移植瘤小鼠免疫系統的影響

MDPE對H22肝癌細胞皮下移植瘤小鼠免疫系統的影響如表2.MDPE 3個給藥組中的白細胞數、胸腺指數、脾指數均高于陽性對照組.當MDPE給藥組劑量為每天1mg／kg時，胸腺指數和脾指數均高于陰性對照組.表明腹腔注射給藥MDPE能夠刺激小鼠胸腺和脾臟的發育，有利于增強免疫功能.胸腺和脾都是免疫細胞存在的場所，所以推測MDPE可能是使免疫器官發生了免疫細胞的數目增多.據報道，CD4＋和CD25＋2種T細胞可以在胸腺中檢測到，它們既可以抑制自身發生免疫疾病，也可以對腫瘤免疫進行調節，它們的抗腫瘤機制可能是抑制腫瘤免疫［14］.NK細胞是一種自然殺傷細胞，屬于先天免疫系統的組成部分，可以抵御機體感染和防止細胞惡性轉化［15］.NK細胞與T淋巴細胞有所不同，它是腫瘤免疫治療的重要效應細胞，不需要腫瘤特異性抗原識別，可以直接殺傷腫瘤細胞［16］.目前，被認可的NK細胞抗腫瘤機制包括3種：以孔素或粒酶介導的腫瘤壞死過程，由NK細胞與腫瘤直接接觸而介導的細胞凋亡，NK 細胞破壞腫瘤微血管系統而引起的腫瘤出血壞死［17］.綜上，MDPE對腫瘤的作用機制值得從免疫細胞方面進行更加深入細致的研究.

表2 MDPE對H22肝癌細胞皮下移植瘤小鼠免疫系統的影響Tab.2 Effects on immune system of H22transplanted subcutaneously models

2.4 MDPE對H22肝癌細胞小鼠骨髓的影響

H22肝癌細胞皮下移植瘤小鼠骨髓有核細胞數目見表3.MDPE（每天給藥1，5，10mg／kg）3個給藥組的骨髓有核細胞數目均高于陽性對照組，結果表明MDPE對骨髓的抑制作用小于順鉑，毒性比較低.

MDPE（每天給藥1，5，10mg／kg）3個給藥組的DNA 抑制率分別為8.68%，15.74%，17.44%，順鉑的DNA 抑制率為17.71%.據文獻報道，順鉑是一種生物烷化劑，其作用機理非常明確.它主要通過引起DNA復制障礙，進而抑制腫瘤細胞的分裂［18］.從表3中可以看到，MDPE 給藥組對DNA 也有一定的抑制率，且隨著給藥濃度的增加，DNA 抑制率也在增加，具有一定的量效關系.這說明，MDPE 對腫瘤的抑制作用也可能是通過影響腫瘤細胞的DNA 而發揮效果，其接下來的作用機理研究可以從DNA 方面出發，進行更加深入的研究.

表3 H22肝癌皮下移植瘤小鼠骨髓有核細胞的影響Tab.3 Effects on bone marrow nucleated cell of H22transplanted subcutaneously models

2.5 MDPE對S180腹水瘤小鼠生命延長率的影響

MDPE對S180腹水瘤小鼠生命延長率的影響見表4.從表4結果可以看出，與陰性對照組相比，MDPE（每天給藥1，5，10 mg／kg）3 個給藥組可以明顯延長S180腹水瘤小鼠的存活時間，生命延長率分別為29.16%，56.66%，79.75%，且隨著給藥濃度的增加，生命延長率也在增加.說明，MDPE 能夠延長S180腹水瘤小鼠生命和抑制S180腹水瘤生長，起到減毒增效的作用，其機理有待于進一步研究.

表4 對S180腹水瘤小鼠存活時間的影響Tab.4 Effects on survival time of the S180ascites tumor models

3 結論

體外實驗顯示：MDPE對SGC7901，A549，Hela，HepG2，H22和S180細胞的抑制作用明顯高于同質量濃度的順鉑，IC50分別為8.44，8.91，7.30，11.04，7.08 和6.93μg／mL.

體內實驗結果表明：MDPE對H22肝癌細胞小鼠皮下移植瘤有很好的抑制作用，以每天1，5，10mg／kg的劑量灌胃給藥，腫瘤抑制率分別為45.33%，50.16%，51.73%；通過考察MDPE 對免疫系統以及骨髓的影響，證實MDPE毒副作用較小；并且MDPE可明顯延長S180腹水瘤小鼠存活時間，每天以1，5，10mg／kg的劑量灌胃給藥，生命延長率分別為29.16%，56.66%，79.75%.

實驗結果表明，MDPE在體外和體內都有很好的抗腫瘤效果，值得進一步深入研究.

［1］ 席云生.抗腫瘤藥物研究進展［J］.中國衛生產業，2012，15：174.

［2］ 陳海燕，馬愛霞，陳在余.我國抗腫瘤藥物市場現狀及發展趨勢研究［J］.北方藥學，2012，9（11）：51－52.CHEN Haiyan，MA Aixia，CHEN Zaiyu.Marketing status and potential analysis for antineoplastic angents［J］.Journal of North Pharmacy，2012，9（11）：51－52.

［3］ 王君明，崔瑛.天然抗腫瘤藥物篩選方法研究進展［J］.時珍國醫國藥，2011，22（8）：1994－1995.

［4］ HOLSHOUSER M H，LOEFFLER L J，HALL I H.Effects of 3－chloromethylthiochromone－1，1－dioxide on nucleic acid，protein，and aerobic and anaerobic metabolism of ehrlich ascites tumor cells［J］.Wiley online library ChemistryViews J Pharm Sci，2006，71（8）：857－861.

［5］ 齊平，靳穎華，郭春，等.3－次芐基硫色滿酮類化合物的合成及其體外抗真菌活性［J］.中國新藥雜志，2004，13（2）：141－143. QI Ping，JIN Yinghua，GUO Chun，et al.Synthesis of 3－benzylthiochromanones and their in vitro antifungal activity［J］.Chinese Journal of New Drug，2004，13（2）：141－143.

［6］ DAS B，CHOWDHURY N，DAMODARK.A mild and efficient stereoselective synthesis of（Z）－and（E）－allyl sulfides and potent antifungal agent，（Z）－3－（4－methoxybenzylidene）thiochroman－4－one from morita－baylis－hillman acetates［J］.Chem Pharm Bull，2007，55（8）：1274－1276.

［7］ 李春納，楊春柳，劉玉欣，等.（順）－3－（氯代亞甲基）－6－甲基－硫色滿－4－酮的體外抗腫瘤活性研究［J］.科學通報，2010，55（31）：3027－3031.

［8］ 蘇立敏，劉玉欣，黃鑫，等.新型硫色滿酮衍生物的體外抗腫瘤活性及作用機制［J］.中國新藥雜志，2012，21（6）：675－680.SU Limin，LIU Yuxin，HUANG Xin，et al.In vitro anticancer effects and possible mechanism of new synthesized thiochromanone derivatives［J］.Chinese Journal of New Drug，2012，21（6）：675－680.

［9］ 楊春柳，李佳，楊更亮.順－6－氟－3－氯代亞甲基－硫色滿－4－酮的體內 抗腫瘤活性研究［J］.醫學研究與教育，2011，28（6）：13－18. YANG Chunliu，LI Jia，YANG Gengliang.Antitumor activity of 3－chloromethylene－6－fluoro－thiochoman－4－one in vivo［J］.Medical Research and Education，2011，28（6）：13－18.

［10］ LIU Tianlin，XIE Jianhua，YU Shengliang.Studies on the synthesis and bioactivities of substituted dihydropyrazole derivatives［J］.Acta Scientiarum Naturalium University Nankaiensis，1999，32（1）：101－104.

［11］ PUIG－BASAGOITI F，TILGNER M，FORSHEY B M，et al.Triaryl pyrazoline compound inhibits flavivirus RNA replication［J］.Antimicrob Agents Chemother，2006，50（4）：1320－1329.

［12］ 蔡樺，吳志兵，鄺繼清，等.吡唑啉類化合物生物活性及研究進展［J］.精細化工中間體，2012，42（5）：1－10.CAI Hua，WU Zhibing，KUANG Jiqing，et al.Research progress and bioactivity of pyrazoline derivatives［J］.FINE CHEMICAL INTERMEDIATES，2012，42（5）：1－10.

［13］ 鄒敏，盧俊瑞，辛春偉，等.1－（2－羥基苯甲酰基）－3－甲基－4－ 取代苯腙基－吡唑啉酮及其中間體的合成、表征及抑菌活性［J］.有機化學，2010，30（8）：1201－1206.ZOU Min，LU Junrui，XIN Chunwei，et al.Syntheisi，characterization and antibacterial activities of 1－（2－Hydroxybenzoyl）－3－methyl－4－substituted phenylhydrazono－pyrazolones and their intermediates［J］.Chinese Journal of Organic Chemistry，2010，30（8）：1201－1206.

［14］ 劉莉，丁乾，曹如波，等.惡性腫瘤患者外周血CD4＋CD25＋調節T 細胞的檢測及其臨床意義［J］.臨床腫瘤學雜志，2005，10（4）：342－345.LIU Li，DING Qian，CAO Rubo，et al.Study on the subset of T lymphocyte and CD4＋CD25＋regulatory cells in peripheral blood of malignancies［J］.Chinese Clinical Oncology，2005，10（4）：342－345.

［15］ 劉德琰，馮凱，陳虎.NK 細胞的生物學特性及臨床應用研究進展［J］.白血病·淋巴瘤，2006，15（2）：142－144.LIU Deyan，FENG Kai，CHEN Hu.Biology and clinical application of human natural killer cells［J］.Journal of Leukemia﹠Lymphoma，2006，15（2）：142－144.

［16］ FARAG S S，VANDEUSEN J B，FEHNIGER T A.Biology and clinical impact of human natural killer cells［J］.Int J Hematol，2003，78（1）：7－17.

［17］ 譚宇婷，曾莉，楊洋.探討NK細胞抗腫瘤治療的現存問題及其免疫治療新途徑［J］.中國醫學工程，2012，20（4）：187－188.

［18］ 姜小萍.鉑族金屬離子的生化作用機理［J］.青海師范大學學報：自然科學版，2004，4：59－62.