土壤中PVA降解菌的分離與篩選

強雪妮，郭雅妮，楊 貞

（西安工程大學(xué) 環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，陜西 西安710048）

聚乙烯醇（PVA）是一種人工合成的水溶性高分子聚合物，具有良好的水溶性、成膜性、黏結(jié)性，被廣泛應(yīng)用于紡織、印染、化纖等多個領(lǐng)域［1］.但由于其化學(xué)耗氧量大，可生化性差，生物降解周期長［2］，每年有大量的PVA廢水產(chǎn)生，造成了嚴重的環(huán)境污染，極大地危害了生態(tài)環(huán)境.因此，PVA廢水的治理受到越來越多人的重視，其中生物處理方法具有降解效率高且無二次污染等優(yōu)點，因此得到了學(xué)者們的廣泛關(guān)注［3］.篩選出能降解PVA的優(yōu)勢菌，對于含PVA廢水土壤的處理具有十分重要的意義.

目前國內(nèi)外許多學(xué)者分離出多株降解PVA的微生物［4－8］，其中以假單胞菌屬較多，芽孢桿菌和不動桿菌較少.同時還有學(xué)者對微生物降解PVA的機理、提取和純化PVA降解酶也進行了相關(guān)研究［9－10］.但大多數(shù)關(guān)于微生物降解PVA的研究多以水體中的降解菌為主，對于土壤中的PVA降解菌的研究不是很多.本文從含PVA土壤中分離篩選出能降解PVA的菌株，并對其進行生理生化鑒定，以期為PVA的生物降解尋找新的菌種來源，完善土壤微生物降解PVA的理論依據(jù).

1 實 驗

1.1 菌種

菌種來自于含PVA的土壤樣品.

1.2 材料

1.2.1 試劑 （1）PVA（化學(xué)純，醇解度為99.8%～100%，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司），其他試劑均為分析純.

（2）硼酸－碘－碘化鉀顯色劑：I液：稱取2.5g KI，置于100mL棕色容量瓶中，加蒸餾水溶解后稱取0.65g碘加入其中，定容備用.Ⅱ液：稱取4g硼酸置于100mL容量瓶，定容至刻度.將I液和Ⅱ液按1∶5比例（1mL I液和5mLⅡ液）混合即成.

（3）細菌形態(tài)觀察及生理生化實驗所用試劑參見文獻［11］.

1.2.2 培養(yǎng)基（1）篩選培養(yǎng)基：PVA 1.0g，NH4Cl 1.0g，酵母膏 0.1g，KH2PO40.2g，K2HPO41.6g，MgSO4·7H2O 0.05g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.02g，CaCl20.05g，NaCl 0.02g，蒸餾水1 000mL，pH＝7.2，121°C滅菌20min.

（2）發(fā)酵培養(yǎng)基：PVA 2.0g，NH4Cl 3.0g，KH2PO40.25g，K2HPO42.0g，MgSO4·7H2O 0.06g，F(xiàn)e－SO4·7H2O 0.02g，CaCl20.05g，NaCl 0.02g，蒸餾水1 000mL，pH＝7.2，121°C滅菌20min.

（3）種子培養(yǎng)基：PVA 1.0g，酵母膏1.6g，KH2PO40.2g，K2HPO41.6g，MgSO4·7H2O 0.5g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.02g，CaCl20.05g，NaCl 0.02g，蒸餾水1 000mL，pH＝7.2.

（4）生理生化實驗所用培養(yǎng)基參見文獻［11］.

1.3 方法

1.3.1 降解PVA混合菌系的分離 將采集到的土壤樣品取1.0g置于0.1mol／L的NaCl溶液中混勻，再取10mL置于裝有100mL篩選培養(yǎng)基的250mL錐形瓶中，于30℃，200r／min下振蕩培養(yǎng)3天后，由搖瓶中吸取2mL混合培養(yǎng)物移入裝有100mL篩選培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，重復(fù)幾次后，檢測、比較不同培養(yǎng)體系中PVA含量的變化，選擇其中PVA含量下降最多的混合培養(yǎng)物繼續(xù)培養(yǎng).

1.3.2 PVA降解菌的篩選與鑒定 （1）光圈法初篩.將菌株點種于選擇培養(yǎng)基平板培養(yǎng)2天，浸入6～8mL顯色劑（硼酸－碘化鉀－碘試劑），置室溫避光與培養(yǎng)基中PVA充分反應(yīng)20min，然后觀察透明圈的有無和大小.有，則表示有酶活；越大，則表示酶活越高.透明圈較大的單菌落保存于NA斜面中，劃線純化后，4℃保存?zhèn)溆?

（2）復(fù)篩.利用平板菌落計數(shù)法調(diào)整初篩所獲菌株菌懸液濃度.取10mL原菌液放入90mL無菌水中，充分振蕩，按此方法逐級稀釋，取10－1，10－2，10－3，10－4，10－5，10－66個稀釋度分別涂平板，每組2個平行樣，30°C恒溫培養(yǎng)，測定PVA的降解效率.

（3）鑒定.將得到純化后的4株菌株進行革蘭氏染色，在400倍顯微鏡下觀察其菌體形態(tài)，具體染色方法步驟參照文獻［11］，并進行一系列生理生化實驗，以鑒定菌種.

1.3.3 PVA降解率的測定 采用H.Jodeph報道的碘量法［12］測定.取一定量的降解液，4 000r／min離心20min，取上清液5mL并稀釋10倍后取出5mL，加6mL顯色劑，再加20mL的蒸餾水搖勻，顯色20min.在比色皿中，以蒸餾水為參比，測定聚乙烯醇與顯色劑形成的有色物質(zhì)在690nm的吸光度，每24h測一次，所測得的吸光度與標準曲線對比得到PVA含量.

式中 Ao為空白試樣（未接種培養(yǎng)基）的吸光值；Ai為降解試樣的吸光值.

2 結(jié)果與討論

2.1 菌種分離篩選及降解條件優(yōu)化

將分離純化得到6株菌分別編號A，B，C，D，E，F(xiàn)，在篩選培養(yǎng)基上于30℃培養(yǎng)2～3天后，觀察其菌落特征，6株菌在分離實驗中菌落周圍均能產(chǎn)生透明圈，即表示6株菌體內(nèi)均有PVA降解酶.菌落特征如表1所示.6株菌株經(jīng)過5天的降解，對PVA的降解情況如圖1所示.

由圖1可知，6株降解菌的降解率最高達到47.6%，最低30%.降解率由大到小依次為E＞F＞C＞A＞B＞D，因此簡化實驗，舍去B，D兩組，以A，C，E，F(xiàn)作為后續(xù)研究對象，繼續(xù)培養(yǎng)5天，其降解情況如圖2所示.

由圖2可知，4株菌體在2g／L的PVA發(fā)酵培養(yǎng)基中經(jīng)過5d的培養(yǎng)，A的降解率由31.6%提高到40.2%，C，E，F(xiàn)的降解效率均有所下降.降解率的大小依次為A＞F＞E＞C.將A，C，E，F(xiàn) 4組純種菌落分別接入到3g／L的PVA發(fā)酵培養(yǎng)基中繼續(xù)馴化，結(jié)果見圖3.

圖1 初篩菌在2g／L的PVA發(fā)酵培養(yǎng)基中的降解

圖2 復(fù)篩菌在2g／L的PVA發(fā)酵培養(yǎng)基中的降解

圖3 4株菌在3g／L的PVA發(fā)酵培養(yǎng)基的降解

圖4 4株菌在4g／L的PVA發(fā)酵培養(yǎng)基中的降解

將圖2和圖3進行比較，可以看出A，C，E，F(xiàn) 4組細菌對PVA的降解效果由大到小的排序為A＞C＞F＞E，菌種A的降解率略有提高，C有大幅度提高，F(xiàn)組的降解率也略有提高，E組略有下降.為了提高菌落的馴化速度，將菌落分別接入到4g／L的發(fā)酵培養(yǎng)基中，并連續(xù)馴化8天后，再將菌種分別接種于對應(yīng)的3g／L的PVA發(fā)酵培養(yǎng)基中，并測定其吸光度，得到圖4.

由圖4可知，A，C，E，F(xiàn)的降解率經(jīng)過8天的馴化后，降解率均有了進一步的提高.降解率由大到小的順序為A＞F＞E＞C，且A菌的降解率達到了61%，最低的C菌也達到了48.4%.經(jīng)過這一系列的馴化，發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)的馴化方式已不能很好地提高PVA降解菌的降解效率，因此停止馴化.之所以降解效率不高，分析原因主要有兩點：一是菌種來自于土壤，土壤中PVA降解菌在水體降解中受到環(huán)境因素的影響；二是PVA降解菌菌種來源單一.后期實驗中從不同樣品源采集多種樣品，增加PVA降解菌菌種的多樣性，以達到更高的PVA降解效率.

3.2 細菌細胞形態(tài)及生理生化實驗結(jié)果

經(jīng)過對A，C，E，F(xiàn) 4株P(guān)VA降解菌革蘭氏染色，在400倍顯微鏡下觀察，如圖5所示，細菌的生理生化實驗結(jié)果見表2.參照《伯杰細菌鑒定手冊》（第八版）和《一般細菌常用鑒定方法》，以及以上細菌生化實驗結(jié)果，判定A為假單胞菌屬，C為球菌屬，E為微球菌屬，F(xiàn)為鏈球菌屬.

表2 細菌細胞形態(tài)及生理生化實驗結(jié)果

3 結(jié) 論

（1）通過對土壤中PVA混合菌系的一系列馴化和篩選，得到4株P(guān)VA降解單菌，降解效率在48%～61%之間，證明土壤中存在PVA降解菌，但須進一步馴化以提高降解率.

圖5 4株P(guān)VA降解菌顯微鏡照片

（2）通過細菌形態(tài)和生理生化實驗表明4株P(guān)VA降解單菌中A為假單胞菌屬，C為球菌屬，E為微球菌屬，F(xiàn)為鏈球菌屬.

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