維吾爾藥指甲花和鳳仙花的定性鑒別研究＊

劉 涵，王金芳，高增平，史家文，石 鉞

(1. 北京中醫藥大學中藥學院，北京 100102; 2. 中國醫學科學院·北京協和醫學院藥用植物研究所，北京 100193)

指甲花Lawsonia inermis L. 是維吾爾醫常用藥材之一，盡管 很常用，但實際上新疆并不出產，從古至今維吾爾醫用指甲花均由國外進口。近幾十年來，由于維吾爾醫藥的發展，進口指甲花已無法滿足維吾爾醫臨床應用和化妝品生產的需求，加之維吾爾族的語言不通、交通不便、信息不暢，不了解我國南方地區也有指甲花的野生和栽培資源，所以誤認為新疆地區栽培的亦能染指甲的鳳仙花Impatiens balsamina L. 即是指甲花[1-4]。同時，盡管指甲花和鳳仙花的原植物科屬不同，前者屬于千屈菜科，后者屬于鳳仙花科，但兩者的葉均可染色，其著色成分也很相似，且植物葉粉碎后難以用肉眼加以區分，這就給臨床應用和市場流通造成很大困難。國外學者曾采用高效液相色譜(HPLC)法或薄層色譜(TLC)法對指甲花的指紋圖譜進行過研究[5-7]，但對于指甲花和鳳仙花的定性鑒別，目前尚未見報道。筆者采用TLC 法和HPLC 法對指甲花和鳳仙花的指紋圖譜進行比較，建立了兩者的特征定性鑒別方法，為指甲花和鳳仙花的正確應用提供試驗依據。

1 儀器與試藥

UVⅢ型暗箱式三用紫外分析儀(北京恒誠基業科貿有限公司);Water2695 型高效液相色譜儀(Waters2996 二極管陣列檢測器);AB135-S 型十萬分之一分析天平(瑞士梅特勒公司);SB-5200D 型超聲波清洗機(中國寧波);TG16 -Ⅱ型高速離心機(中國長沙);薄層層析用硅膠G(青島海洋化工廠)。甲醇和三氟醋酸(TFA)為色譜純;水為娃哈哈純凈水;其他化學試劑均為分析純。指甲花葉分別自采和購買于福建、海南、云南、廣東、印度和巴基斯坦，鳳仙花葉自采于新疆和北京，原植物由中國醫學科學院藥用植物研究所石鉞研究員鑒定。

2 方法與結果

2.1 TLC 鑒別

稱取0.5 g 樣品的干燥粉，精密稱定0.1 mg，過40 目篩，置50 mL 具塞刻度離心管中，精密加入20 mL甲醇，稱定質量，超聲處理30 min(控制超聲溫度在30 ℃以下)，置室溫，稱定質量，用甲醇補足減失的質量，以5 000 r/min的速率離心5 min，取上清液，即得供試品溶液。精密吸取上述溶液各1 μL，分別點于同一硅膠G 薄層板上，展開前先預飽和30 min，用氯仿-甲醇(12 ∶1)為展開劑展開，展距在8 cm 以上，取出，晾干，置365 nm波長紫外光燈下檢識。結果6 種不同產地的指甲花均可檢出Rf 為0.45 和0.51 的紅色熒光斑點，鳳仙花未檢出;鳳仙花可檢出Rf=0.74 的紫色熒光斑點，指甲花未檢出(見圖1)。試驗結果表明，指甲花和鳳仙花的薄層色譜有顯著性差異。

圖1 藥材薄色譜圖

2.2 HPLC 鑒別

2.2.1 色譜條件

色譜柱:Diamonsil? C18(2)色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);流動相:A 為甲醇，B 為0.05%TFA 水溶液，按表1 方法進行梯度洗脫;流速:1.0 mL/min;柱溫:30 ℃;進樣量:10 μL;在線檢測波長:245 nm。

2.2.2 供試品溶液制備

取2.1 項下供試品溶液，用0.45 μm 濾膜過濾，作為供試品溶液。

2.2.3 方法學考察

精密度試驗:取同一指甲花供試品溶液，按擬訂色譜條件連續進樣6 次，測定指紋圖譜，考察各共有指紋峰的相對保留時間和峰面積。結果顯示，各共有指紋峰相對保留時間的RSD 均小于2% (0.030% ～1.400% )，各 峰 峰 面 積 的 RSD 均 小 于3%(0.371% ～2.435%)，符合相關規定，表明其精密度良好。

表1 甲醇-0.05%TFA 水二元梯度表

重復性試驗:精密稱取同一指甲花樣品，平行操作6 份，每份約0.5 g，按2.2.2 項下方法制備供試品溶液并測定指紋圖譜，考察各共有指紋峰的相對保留時間和峰面積。結果顯示，各共有指紋峰相對保留時間的RSD 均小于1%(0.040% ～0.263%)，各峰峰面積的RSD 均小于2%(0.320% ～1.500%)，符合相關規定，表明其重復性良好。

穩定性試驗:取同一供試品溶液，分別于0，2，4，6，8 h 時按擬訂色譜條件進樣測定指紋圖譜。結果顯示，各共有指紋峰相對保留時間的RSD 均小于2%(0.011% ～1.342%)，各峰峰面積的RSD 均小于5%(0.359% ～4.809%)，表明指甲花供試品溶液在8 h 內基本穩定。但隨著時間的增加，某些峰的峰面積逐漸減小，影響測定，故指甲花供試品溶液最好現用現配，且應在8 h 內進行測定。

2.2.4 結果

按2.2.2 項下方法制備指甲花和鳳仙花的供試品溶液，在擬訂色譜條件下進樣。測定各批供試品溶液的指紋圖譜，記錄時間為105 min。色譜圖見圖2 至圖5。

圖2 2 批鳳仙花藥材指紋圖譜的疊加圖

圖3 6 批指甲花藥材指紋圖譜的疊加圖

圖4 2 批鳳仙花藥材和6 批指甲花藥材指紋圖譜的疊加圖

圖5 指甲花藥材的特征色譜峰

因鳳仙花種類和分布過于廣泛，本研究中僅通過對北京和新疆兩個產地差別較大的鳳仙花進行HPLC 鑒別研究，結果見圖2?？梢?，不同產地的鳳仙花化學成分可能無顯著性差異。因目前指甲花在國內種植很少，故僅能對已知分布在福建、海南、云南、廣東等地的栽培指甲花和市場中流通最廣的印度、巴基斯坦指甲花進行分析研究，結果見圖3?？梢?，不同產地的指甲花化學成分雖有一定差異，但仍具有明顯的共有特征。通過對鳳仙花和指甲花HPLC 指紋圖譜的比較(見圖4)，發現鳳仙花和指甲花的化學成分確實存在相似性，但各自又有其明顯的特異性。鳳仙花中所含極性較大的化學成分含量明顯低于指甲花，通過指甲花的共有峰與鳳仙花的比較，共確定了8 個指甲花的特征性色譜峰(見圖5)，其保留時間分別為t1=2.797，t2=8.633，t3=22.606，t4=35.962，t5=52.996，t6=57.233，t7=58.569，t8=71.137。

3 討論

指甲花與鳳仙花均有染色作用，且植物葉粉碎后難以用肉眼加以區分，但實際上是兩種不同科屬的植物，應嚴格區別，不能混用。本研究中建立了指甲花和鳳仙花的TLC 和HPLC 鑒別方法，結果表明，所建立的TLC 法可初步鑒別指甲花和鳳仙花;HPLC法鑒別表明，不同產地的鳳仙花化學成分可能差別不大，不同產地的指甲花雖存在一定的差異性，但仍具有明顯的共有特征。利用HPLC 法鑒別指甲花和鳳仙花時，可根據其極性較大的化學成分的含量結合是否具有指甲花的特征色譜峰加以判斷。本研究方法的建立，也為維吾爾藥指甲花的質量控制提供了鑒別依據。

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