ＩＬ－２和ＩＬ－１２對肺部真菌感染小鼠的血清ＩＦＮ－г和一氧化氮水平的影響

摘 要：目的：研究 IL-2、IL-12單用及聯用對小鼠血清IFN-г水平的影響。方法：①通過建立小鼠肺部曲霉感染模型。將60只已建立免疫功能低下模型的小鼠隨機分為A、B、C、D四組，每組15只。A組用IL-2+IL-12治療；B組用IL-12治療；C組用IL-2治療；D組用生理鹽水治療，作為對照組。檢測各組小鼠血清г-干擾素(г-IFN)。肺組織菌落計數。結果：①A組、B組、C組、D組小鼠的血清г-干擾素(г-IFN)水平，各組間比較，差異無顯著性(P>0.05)；A組、B組、C組、D組各組小鼠肺組織菌落數。IL-2+IL12組與IL-2組、IL-12組比較，差異均有顯著性(P<0.05)。生理鹽水治療組與其他組比較，差異有顯著性(P<0.05)。結論： IL-2和IL-12聯用與否對血清г-干擾素(г-IFN)水平無顯著性影響，但IL-2和IL-12聯合治療組較單獨使用能減少肺組織的菌落數。

關鍵詞：真菌；白介素12；白介素2；免疫；肺；干擾素-г；一氧化碳

中圖分類號：R392.7 文獻標識碼：A 文章編號：1673-2197(2008)05-011-02

流行病學調查發現，深部真菌感染病例在逐漸增多。真菌感染與機體免疫功能關系密切，一方面深部真菌感染多發生于機體免疫功能低下的患者，另一方面真菌感染可進一步降低機體的免疫，導致感染的進一步加重。

盡管新的抗微生物制劑不斷問世，但由于耐藥性的問題，或由于藥物的毒副作用等諸多因素，抗微生物治療仍面臨重大挑戰，有效的宿主保護性免疫在防治感染性疾病方面有著不可替代的作用。目前國內外的研究結果表明：IL-2和IL-12聯用具有協同刺激Thl反應，加速病原清除，防止感染慢性化的作用^[1]。國內外尚未見將IL-2和IL-12聯用于真菌感染的治療報道。我們采用IL-2和IL-12對肺部真菌感染的小鼠進行了實驗研究。

1 材料與方法

1.1 制作實驗動物模型所需主要材料

實驗所用小鼠為6~8周齡雄性清潔組BALB/c小鼠，購自中山醫科大學實驗動物中心。煙曲霉菌菌株購自廣東省微生物研究所。用于制造感染模型的環磷酰胺購自江蘇連云港制藥廠，批號：9711182，氫化可的松購自揚州制藥廠，批號：980101，苯巴比妥鈉購自廣東制藥廠，批號：980625。

1.2 實驗動物治療藥品

白細胞介素2(IL-2)購自北京四環生物工程制品廠，批準文號：(97)衛藥準字S-03號。基因重組的白細胞介素12(IL-12)由日本琉球大學醫學部贈，效價(2.5×108Roche units/mg)。

1.3 檢測試劑

r-干擾素(r-IFN)檢測試劑盒購自Diaclone生物公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 免疫功能低下的小鼠實驗模型制作方法

免疫功能低下的小鼠實驗模型制作方法是在粒細胞減少的小鼠感染模型制作方法基礎上進行的。具體制作方法參照Smith等^[2，3]的報道。

1.4.2 治療方法

將60只已建立免疫功能低下模型的小鼠隨機分為A、B、C、D四組，每組15只。A組IL-2+IL-12治療；B組單用IL-12治療；C組單用IL-2治療；D組生理鹽水治療，作為對照組。IL-2的用量為每只小鼠6mg/kg，分兩次分別于建立模型后的第二天和第五天腹腔注射。IL-12從建立模型后的第二天開始用藥，連續用藥5d。IL-2和IL-12的用量參照Kawakami等^[4]的報道。

1.4.3 血清r-干擾素(r-IFN)的檢測

血清r-干擾素(r-IFN)的檢測方法按試劑盒說明書的要求進行。利用SPSS8.0統計軟件包求出直線回歸方程，將標本的OD值代入直線回歸方程，求出各標本的r-干擾素(r-IFN)濃度(pg/ml)。

1.4.4 肺組織菌落計數方法：無菌分離小鼠的肺組織，取一小部分肺組織固定于10%的福爾馬林中，以作病理檢查。將其余的肺組織稱重，置于研缽內用組織勻漿器碾細，篩網過濾，稀釋10倍后，取1ml加入培養皿中，再加入一定量的溶化了的沙保氏培養液，培養1d后計數培養皿中的煙曲霉菌菌落數。

1.5 數據統計

采用SPSS8.0統計軟件包進行分析，計量資料采用t檢測和方差分析。

2 結果

(1)各治療組小鼠血清IFN-r的測定結果比較(表1，每組6例)

(2)各組小鼠肺組織菌落數(表2，以log形式表示，菌落數/每克肺組織)

3 討論

IL-12是由B細胞和單核細胞產生的。在感染過程中，它能誘導自然殺傷細胞和T細胞產生干擾素，發生Thl細胞免疫反應。IL-12在Th0細胞分化為Thl細胞過程中發揮中心作用，起著“總開關”的作用。IL-12的抗感染機制通過巨噬細胞等在外來病原體或其產物的作用下，在短時間內產生IFN-r及Thl效應。在免疫缺陷機體中IFN-r可活化巨噬細胞的殺滅微生物機制，限制胞內微生物的增殖^[5，6]。一氧化氮(NO)和腫瘤壞死因子a(TNFa)在調節巨噬細胞的吞噬活性方面起著很重要的作用。

r-干擾素(IFN-r)調節效應細胞(如中性粒細胞和巨噬細胞等)功能的分子機制雖不清楚，但許多實驗已證實它確實能增強中性粒細胞、巨噬細胞和NK細胞的吞噬、殺菌能力。在真菌感染過程中，r-干擾素能增強中性粒細胞、巨噬細胞和NK細胞對白色念珠菌、組織胞漿菌、曲霉菌、隱球菌等真菌感染的清除。Kawakami等^[4]的研究結果表明，IL-12能促進IFN-rmRNA在感染部位的表達，但未檢測血清IFN-r水平。本研究發現IL-2和IL-12聯合治療組的血清r-干擾素水平與單用組相比，差異無顯著性，與生理鹽水組也無差異(p>0.05)。是否IFN-r的作用只與IFN—rmRNA在感染部位的表達有關，而與血清IFN-r水平無關?也可能與采標本的時間有關。本研究的血清標本是在感染結束階段采樣的，故不能觀察到血清-干擾素的變化。對此問題有待進一步研究。本研究中觀察到，血清r-干擾素與血清一氧化氮的水平不一致，可能與這兩種細胞因子的感染過程的不同階段的分泌量不同有關。r-干擾素一般在感染的早期分泌較多，隨后逐漸減少，而一氧化氮則持續產生，有利于機體清除感染病灶^[6]。

參考文獻：

[1] Cenci E，Mencacci A，Bacci A，et al.T cell vaccination in mice with invasive pulmonary aspergillosis[J].J Immunol，2000，165：381~388.

[2] Ampel NM，kramer LA.In vitro modulation of cytokine production by lymphocytes in human coccidioidomycosis[J].Cell Immunol，2003，221(2)：115~121.

[3] Romano CC，Mendes-Giannini MJ，Duarte AJ，et，al.IL-12 and neutralization of endogenous IL-10 revert the in vitro antigen-specific cellular immunosuppression of paracoccidioidomycosis patients[J].Cytokine，2002，18(3)：149~157.

[4] Kawakami k，Tohyama，M，Xie QF，et al.Interleukin-12 protects mice against pulmonary and disseminated infection caused by cryptococcus neoformans [J].Clin Exp Immunol，1996，104：208~214.

[5] Maffei CM，Mirels LF，Sobel RA，et al.Cytokine and inducible nitric oxide synthase mRNA expression during experimental murine cryptococcal meningoencephalitis[J].Infect Immun，2004，72(4)：2338~2349.

[6] Bocca，AL，Hayashi AG，Pinheiro AB，et al.Treatment of Paracoccidioides brasiliensis-infected mice with a nitric oxide inhibitor prevents the failure of cell-mediated immune response [J].J Immunol，1998，161：3056~3063.

(責任編輯：陳涌濤)