甲基化特異性多重連接探針擴增及甲基化特異性PCR診斷Prader-Willi綜合征方法比較

王 薇，魏 珉，宋紅梅，邱正慶，施惠萍，趙時敏

中國醫學科學院 北京協和醫學院 北京協和醫院兒科， 北京 100730

·論 著·

甲基化特異性多重連接探針擴增及甲基化特異性PCR診斷Prader-Willi綜合征方法比較

王 薇，魏 珉，宋紅梅，邱正慶，施惠萍，趙時敏

中國醫學科學院 北京協和醫學院 北京協和醫院兒科， 北京 100730

目的 應用甲基化特異性PCR(methylation-specific PCR，MS-PCR)和甲基化特異性多重連接探針擴增(methylation-specific multiplex ligation-dependent probe amplification，MS-MLPA)方法對Prader-Willi綜合征(Prader-Willi syndrome，PWS)進行診斷并比較兩種方法的差異。方法 回顧性研究2005年10月至2014年2月到北京協和醫院就診的患兒及正常對照共102例，男57例，女45例。其中正常對照16例；熒光原位雜交或高分辨染色體確診PWS陽性對照2例；臨床疑似PWS患兒84例。提取受試者外周血基因組DNA分別應用MS-PCR及MS-MLPA方法進行基因分析，對疑似患兒進行確診和遺傳類型分型，并計算兩種方法的特異性、敏感性及準確度，應用卡方檢驗對兩種方法進行比較。結果 MS-PCR結果示正常對照及陽性對照與其表型全部相符，84例疑似患兒中有39例提示為PWS，45例提示正常。MS-MLPA結果示除正常對照外的86例受試者中，29例提示為父源缺失型PWS；9例提示為母源二體型PWS；47例提示為正常；1例因DNA過于陳舊未檢出有效結果。對比兩種方法檢測結果，有2例MS-PCR結果顯示為PWS，但MS-MLPA結果顯示為正常，通過增加DNA用量重新進行MS-PCR檢測后，除外PWS。結合臨床表現，受試者中明確診斷PWS的患兒39例，非PWS者63例。MS-PCR方法共出現2例假陽性，假陽性率為3.17%(2/63)。MS-PCR方法敏感性100%，特異性96.83%,準確度98.03%；MS-MLPA方法敏感性97.43%，特異性100%，準確度99.02%。兩種方法的敏感性、特異性及準確度差異無統計學意義(P均>0.05)。結論 MS-PCR及MS-MLPA敏感性、特異性及準確度皆佳，均可用于PWS診斷，MS-MLPA可區分父源缺失型及母源二體型。MS-PCR應保證DNA用量充足以避免假陽性出現。MS-MLPA應使用新鮮提取的DNA，且實驗條件要求更為嚴格。建議同時使用兩種方法檢測以獲得準確結果。

Prader-Will綜合征；甲基化特異性PCR；甲基化特異性多重連接探針擴增

MedJPUMCH,2014,5(4):369-375

Prader-Willi綜合征(Prader-Willi syndrome，PWS)是多系統異常的復雜臨床綜合征，新生兒發病率為1∶12 000～15 000[1]。該病為15q11-13區域的父源印記基因缺陷所致，由于基因印記不同，正常人非甲基化的父源等位基因具備功能活性，而甲基化的母源等位基因沒有活性[2]。主要臨床特征包括:新生兒肌張力低下、發育遲緩、身材矮小、行為異常、童年期開始肥胖、下丘腦性性腺發育不良及長顱、窄臉、杏仁眼、小嘴、薄上唇、嘴角向下的特征性外貌,脊柱側凸也很常見(37.5%)， 且隨年齡增長而發病率增高[1，3- 4]。目前已有PWS的臨床診斷標準[1]，但對于很多疑似患者，僅根據臨床癥狀很難確診，需要使用分子生物學方法進行遺傳基因的分析。PWS患者的主要遺傳類型有：15q11- 13區域約 6 Mb的父源染色體缺失(約70%)、母源同源二體(maternal uniparental disomy，mUPD，20%～25%)、印記中心微缺失及突變(1%～5%)，以及少量的染色體平衡易位[3]。目前的基因分析診斷方法包括:高分辨染色體分析、熒光原位雜交(fluorescenceinsituhybridization，FISH)、甲基化特異性PCR(methylation-specific PCR, MS-PCR)及甲基化特異性多重連接探針擴增(methylation-specific multiplex ligation-dependent probe amplification, MS-MLPA)等。本實驗室已經成功建立MS-PCR診斷PWS的方法[5]，該方法便捷、耗時短、特異性高。MS-MLPA是近十年開始興起的，用于檢測拷貝數變異的一種快速、高通量、多位點檢測新方法。Nygren等[6]最早應用，目前商品化的試劑盒主要由MRC-Holland公司開發。本研究目的即為分別應用MS-PCR及MS-MLPA方法進行基因分析，對PWS疑似患者進行確診以及遺傳類型分型，并比較兩種診斷方法的差異。

對象和方法

研究對象

2005年10月至2014年2月到北京協和醫院就診的患兒及正常對照共102例，男57例，女45例。其中正常對照16例；明確陽性PWS對照2例(作為MS-PCR的陽性對照)，這2例患兒據1993年PWS國際臨床診斷標準[1]，主要診斷標準評分均>8分，1例經過FISH確診，1例經過高分辨染色體分析證實；臨床疑似PWS患兒84例。

外周血DNA提取

在取得受試者知情同意后，取其抗凝靜脈外周血，常規提取基因組DNA，置于-20 ℃冰箱保存。2005年10月至2008年9月DNA提取方法為酚-氯仿法抽提DNA，溶于TE保存。2008年9月至2010年7月DNA提取方法為威格拉斯生物技術北京有限公司溶液型試劑提取，溶于TE保存。2010年7月以后應用北京博邁德生物技術有限公司柱型全血DNA提取試劑盒提取，溶于試劑盒中自帶的洗脫緩沖液保存。

MS-PCR方法檢測

MS-PCR在患者就診半年內檢測，將基因組DNA用CpGenomeTMFast Modification 試劑盒進行亞硫酸鹽修飾；以正常人為陰性對照，臨床診斷患者為陽性對照，未修飾的基因組DNA為系統對照，應用M(母源)、P(父源)兩對引物同時對修飾后產物進行PCR擴增；擴增產物以4%瓊脂糖凝膠電泳分離。具體修飾方法、引物序列及PCR條件見文獻[5]。

MS-MLPA方法檢測

MS-MLPA在2010年開始開展，多數樣本在2011年之后檢測，之前的患者取凍存DNA進行檢測。應用SALSA MLPA ME028試劑盒，按照說明書及參考文獻[7]進行操作。MS-MLPA (P028 PWS/AS)探針混合物共有50對探針。100 bp、105 bp分別為X染色體、Y染色體特異性探針，屬于性別判斷探針。另外29個是PWS/AS判別區(15q11-q12)特異性探針，有9對(含3對消化對照探針，位于184、348、 463 bp)具有HhaⅠ限制性內切酶酶切位點的探針為甲基化敏感性探針，用于判斷酶切是否完全。位于348 bp含有HhaⅠ酶切位點的探針，由于其目的基因通常保持完全的非甲基化，不能用作基因分型，所以另外含有HhaⅠ酶切位點的5對探針(位于142、178、190、250、418 bp)是用來判別基因分型的探針[8]。

MS-MLPA每批次所使用的樣本盡量應用同一種方法提取的DNA。將100 ng基因組DNA與多重探針雜交16 h過夜后，平均分成兩管(C管、M管)，分別進行連接及消化反應。其中C管用于拷貝數檢測,M管用于進行甲基化檢測。連接及消化反應完成后，分別于C管或M管取出5 μl反應液進行PCR反應，反應體系如下：5 μl反應液(C或M),2 μl SALSA PCR緩沖液、13 μl去離子水及5 μl聚合酶混合液。PCR條件:72 ℃預熱PCR儀后放入樣品，95 ℃變性30 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min，共35個循環后再72 ℃延伸20 min。將PCR產物于北京擎科生物技術有限公司應用短串聯重復序列分離檢測方法將同批次的C產物及M產物進行片段檢測。應用GeneMarker V1.5軟件，以正常人為對照，對結果進行分析。

統計學處理

應用SPSS 19.0統計軟件進行統計學處理。計算MS-PCR和MS-MLPA兩種方法的敏感性、特異性及準確度。使用卡方檢驗對兩種方法進行比較，P<0.05為差異有統計學意義。同時對兩種檢測方法的耗時、條件需求等方面進行對比分析。

結 果

MS-PCR檢測結果

未經修飾的系統對照不顯示任何條帶，正常對照同時顯示M(174 bp)、P(100 bp)兩條帶，2例陽性對照均僅顯示M帶。84例疑似患兒中有39例僅顯示M帶，提示為PWS，其余45例同時顯示M、P兩條帶，提示為非PWS(圖1)。

MS-MLPA檢測結果

以正常人拷貝數檢測圖作為對照，設定內參后進行標準化，正常人拷貝數檢測中所有29個PWS/AS判別區探針標準化值(C值)為1；甲基化檢測中，3個消化對照探針標準化值(D值)為0，證明HhaⅠ酶切消化完全；5個基因分型特異性探針的標準化值(M值)為0.5(圖2A)。在2例臨床診斷PWS患兒以及84例臨床疑似PWS患兒中，47例疑似患兒C值為1，D值為0，M值為0.5，提示為非PWS(圖2B)；有29例C值為0.5，D值為0，M值為0.5(圖2C、D)，提示為父源缺失型PWS；9例C值為1，M值為1，提示為mUPD型PWS(圖2E)。1例無有效結果，檢測失敗。

圖 1 MS-PCR檢測結果N:疑似患兒中提示為非PWS；PWS:疑似患兒中提示為PWS；PWSC：臨床確診的PWS陽性對照；SC：系統對照；NC：正常對照；MS-PCR：甲基化特異性PCR；PWS：Prader-Willi綜合征

圖 2 受試者MS-MLPA分析結果 A.男性正常對照；B.疑似患兒中提示為非PWS的男性患兒；C.疑似患兒中提示為父源缺失型PWS的女性患兒；D.疑似患兒中提示為父源缺失型PWS的男性患兒；E. 疑似患兒中被診斷為母源同源二體型PWS的女性患兒 MS-MLPA：甲基化特異性多重連接探針擴增；PWS：同圖1

兩種方法特異性、敏感性及準確度比較

102例受試者經兩種方法檢測，以方法提示為PWS作為陽性結果(+)，提示為非PWS作為陰性結果(-)，結果兩種方法均為陽性38例，均為陰性61例。有2例受試者MS-PCR結果為陽性而MS-MLPA為陰性，重新取凍存的DNA,增加DNA的量至原來的2倍，再次進行MS-PCR后結果提示為陰性，對原結果進行了糾正。有1例MS-MLPA(2011年10月檢測)無結果，MS-PCR(2010年8月檢測)提示陽性，后取其凍存DNA反復進行了3次MS-MLPA仍無有效結果,因剩余DNA量過少，無法再次進行MS-PCR。本例結合臨床資料，其臨床評分為8分，達到了臨床診斷標準，被診斷為PWS。本研究受試者中最終明確診斷為PWS的患兒39例，非PWS者63例。據此分別計算兩種方法的敏感性、特異性及準確度并進行比較，發現兩種方法的敏感性、特異性及準確度差異無統計學意義(P均>0.05)(表1)。

在明確分型的38例患者中，mUPD型PWS有9例(23.68%)，父源缺失型PWS有29例(76.32%)。

兩種方法檢測條件及適用范圍對比

在方法建立及檢測的過程中，MS-MLPA有以下要求：(1)DNA的提取方式及DNA的溶劑應一致，否則容易得到無效結果。(2)每批次不能進行過多樣本檢測，本實驗室能得到有效結果的單次最大樣本量為15個，最佳樣本量在8個以下。而MS-PCR無這些限制，最多一次檢測過30個樣本，結果良好，未進行更多樣本量嘗試。兩種方法在其他方面的對比見表2。

表 1 MS-PCR及MS-MLPA兩種方法診斷PWS的敏感性、特異性、準確度比較(%)

MS-PCR、PWS：同圖1；MS-MLPA：同圖2

討 論

PWS患者有4種主要遺傳類型，其中父源缺失型和mUPD型占90%以上。在目前常用的分子生物學診斷方法中，高分辨染色體分析僅適用于較大的缺失或染色體異常，FISH雖可作為染色體分析的補充，檢出存在微缺失的PWS患者，但mUPD型或印記中心突變的患者卻由于不存在基因缺失而被漏診。MS-PCR方法耗時短、需標本量少,是一種快速、高效、特異性、敏感性均佳的分子診斷方法。MLPA是近幾年發展起來的一種探測拷貝數量改變的新方法，可以在單一反應中檢測多個染色體上不同的位點。MLPA可以用于基因組DNA的檢測，也可以用于mRNA的檢測?，F在已經有超過500個實驗室使用MLPA來探測各種基因的重復和缺失，將其應用于多種基因缺失性疾病的診斷。MS-MLPA是檢測目的DNA序列是否甲基化的一種MLPA，基于母源與父源甲基化程度的不同，從而對PWS進行診斷。MS-PCR及MS-MLPA可以診斷占PWS絕大多數的父源缺失型和mUPD型，但對于染色體平衡易位和印記中心突變無法檢測。

MS-MLPA的甲基化檢測原理為[6]：MS-MLPA試劑中含有幾對甲基化特異性探針，分別對應不同的檢測位點，且最終產物的片段長度不同。每一對特異性探針都由A、B兩條探針組成，其中A探針由一段通用引物X及一段序列特異性探針a組成，B探針由一段序列特異性探針b、一段熒光序列及一段通用探針Y組成?；蚪MDNA經探針雜交后，進行連接反應及特異性限制內切酶的消化反應。由于其甲基化程度不同，甲基化的基因組DNA序列經連接酶將A、B探針連接起來，并且不被內切酶消化；而未被甲基化的基因組DNA序列A、B探針被連接后，由于存在酶切位點而被消化掉。應用通用引物X及Y進行PCR擴增，則連接上的探針可以進行PCR擴增，而被消化掉的探針不能擴增。進行片段分析后即可看出差異。

正常人該區域為CpG島富含區，且母源染色體甲基化，父源染色體未被甲基化。因此以正常人拷貝數檢測圖作為對照，設定內參后進行標準化，則非PWS者的拷貝數檢測中所有29個PWS/AS判別區探針標準化值(C值)為1；甲基化檢測中，由于僅來源于母源的染色體被甲基化，所以在5個基因分型特異性探針的標準化值(M值)為0.5。父源缺失型PWS患者由于父源染色體缺失，C值降為0.5；母源染色體保持甲基化，所以M值仍為0.5。mUPD型PWS患者雖然父源染色體缺失，但由于母源染色體為二體，所以C值為1，M值為1[7]。

表 2 MS-PCR與MS-MLPA檢測條件及適用范圍對比

MS-PCR、PWS：同圖1；MS-MLPA：同圖2

PWS及天使綜合征(Angleman syndrome,AS)的致病區域均在PWS/AS判別區，這兩種方法對該區域檢測均可用于診斷這兩種疾病，但MS-PCR根據甲基化的不同僅能判斷母源染色體或父源染色體是否存在，不能對拷貝數進行定量，所以能診斷但不能判斷患者是mUPD型或是父源缺失型。MS-MLPA在進行拷貝數檢測上具有獨特的優勢，可以明確判斷患者相應染色體是單體還是雙體。再結合甲基化檢測，如果檢測到的是單體且甲基化的則為PWS；單體未甲基化則為AS；二體均為甲基化則為mUPD型PWS；二體均未甲基化則為父源二體AS；如果一為甲基化，一未甲基化則除外此兩種疾病。

本研究中兩種方法的特異性、敏感性及準確度都在95%以上，且兩種方法比較差異均無統計學意義，說明兩種方法特異性、敏感性及準確度皆佳，適用于臨床。MS-PCR中2例受試者出現了假陽性(僅出現了M帶)，假陽性率為3.17%(2/63)，經過上調DNA可糾正結果。MS-PCR同時在一管反應液中放入兩對引物，在同一種PCR條件下進行擴增，兩對引物的最適擴增條件并不完全一致，所以可能會出現某對引物的優勢擴增，而導致這種現象。MS-MLPA有1例受試者未檢測出有效結果，該受試者進行MS-MLPA時間距DNA提取超過1年，且應用試劑為威格拉斯溶液型試劑盒，該方法所得到的DNA雜質多，會有大塊無法溶解絮狀物存在，可能DNA被大量降解。MS-MLPA在最初要進行DNA定量，且加入的DNA量很少(100 ng左右)，被加入的有效DNA可能遠低于測定值，導致結果失敗。

兩種方法耗時均為2 d，但MS-MLPA所需DNA量遠低于MS-PCR，對于新生兒及兒童無法獲得更多血樣時可以優先選擇MS-MLPA。MS-PCR僅能根據兩個位點進行判斷(M帶和P帶)，而MS-MLPA在單次反應中可以判斷數十個拷貝數位點，再結合甲基化的5個位點，其結果可信度高。MS-MLPA實驗條件要求更為嚴格，因為其要進行定量比較，并需要正常對照進行標準化，所以最初加入的DNA質量要好，DNA溶劑、提取方法要一致，才能保證加入的DNA濃度與檢測濃度一致，進而保證最后的結果。如果同一批次檢測過多樣本，每個樣本要同時檢測兩管(C管和M管)，會導致各步驟總體操作時間過長，使操作的第一個樣本和最后一個樣本之間的實際反應時間相差過大，而導致最后的定量失敗。所以MS-MLPA單次不能檢測過多樣本，本實驗室經驗是8例左右最佳。MS-PCR因為不涉及定量，僅要求定性(判斷條帶的有或無)，所以只需保證DNA質量好、量足夠即可，對于提取方法、單批次檢測樣本量沒有限制。

綜上所述，本研究通過MS-PCR及MS-MLPA兩種方法共同診斷了38例明確分型的PWS，9例為mUPD型，29例為父源缺失型，其比例基本符合國際上的報道。兩種方法的特異性、敏感性及準確度皆佳且無明顯差異。MS-MLPA及MS-PCR最好使用新鮮DNA，并應用能獲得高質量的DNA提取方法。MS-MLPA用血量少，適用于兒童，但其檢測要求嚴格，樣本量大且DNA來源廣泛不一致時可以選擇MS-PCR。為了對患者負責，最好兩種方法同時進行，以降低誤診率。對于臨床高度懷疑PWS，但兩種方法均提示正常的患者可以進行高分辨染色體分析，探討是否存在染色體平衡易位，或者測序尋找是否存在印記中心基因突變。

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Comparison between Methylation-specific Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification and Methylation-specific PCR in Diagnosis of Prader-Willi Syndrome

WANG Wei,WEI Min,SONG Hong-mei,QIU Zheng-qing, SHI Hui-ping, ZHAO Shi-min

Department of Pediatrics, Peking Union Medical College Hospital,Chinese Academy of Medical Sciences &Peking Union Medical College, Beijing 100730,China

SONG Hong-mei Tel: 010-69156271, E-mail:songhm1021@hotmail.com

Objective To compare the diagnostic effectiveness of methylation-specific PCR (MS-PCR) and methylation-specific multiplex ligation-dependent probe amplification (MS-MLPA) in clinical suspected Prader-Willi syndrome (PWS). Methods One hundred and two participants (57 males and 45 females) who visited Peking Union Medical College Hospital in the period from October 2005 to February 2014 were included in

this retrospective study. Among the 102 participants, 16 were normal controls, 2 PWS cases confirmed by fluorescenceinsituhybridization or high resolutin banding were positive controls, and 84 were suspected PWS cases. Genomic DNA was extracted for MS-PCR and MS-MLPA, based on which diagnoses were made and genetic types distinguished. Chi-squared test was used to compare the sensitivity, specificity, and accuracy of the two methods. Results MS-PCR results showed that all normal controls and positive controls were conform to their phenotypes. Thirty-nine in the 84 suspected patients were shown to be PWS, and the other 45 to be normal. MS-MLPA showed that in the 86 non-normal participants (positive control and suspected cases), 29 had paternal deletions, 9 had maternal uniparental disomy (mUPD), 47 were normal; and the assay failed to produce effective result in 1 case due to the overlong DNA storage time. Two participants were diagnosed as PWS cases by MS-PCR but normal by MS-MLPA. The diagnosis of PWS was ruled out by repeat MS-PCR after doubling DNA dosage. Combined with clinical manifestations, 39 participants were definitively diagnosed as PWS, the other 63 were not PWS. The false-positive rate of MS-PCR was 3.17%(2/63).The sensitivity, specificity, and accuracy of MS-PCR were 100%, 96.83%, and 98.03%, respectively; while those indicators of MS-MLPA were 97.43%, 100%, and 99.02%, respectively, showing no significant difference (allP>0.05). Conclusions Both MS-PCR and MS-MLPA have high sensitivity, specificity, and accuracy, thus are effective for PWS diagnosis. MS-MLPA can distinguish paternal deletion and mUPD. Enough dose of DNA is requisite in MS-PCR to avoid false-positive results. Freshness of DNA samples is essential in MS-MLPA, which also needs more strict performance standards. We suggest a combination of MS-PCR and MS-MLPA in diagnosing PWS to ensure the accuracy of the result.

Prader-Will syndrome; methylation-specific PCR; methylation-specific multiplex ligation-dependent probe amplification

楊森科學研究委員會中國分會研究基金(2011—2012年)和北京協和醫院中青年基金(2012年)

宋紅梅 電話：010-69156271, E-mail：songhm1021@hotmail.com

R394-33

A

1674-9081(2014)04-0369-07

10.3969/j.issn.1674-9081.2014.04.003

2014- 08- 04)