雪膽中抗MRSA內生細菌的多樣性

康琳 魏金莉 胡蝶 劉佳鳳 王毅鵬 楊帥丹 龔明福

摘要：從雪膽多種組織中分離、篩選出抗MRSA的菌株，采用總DNA ERIC-PCR方法和16S rRNA基因全序列分析方法，對抗MRSA的雪膽內生細菌進行遺傳多樣性和系統發育分析。結果表明，雪膽內生細菌非常豐富，分離獲得25株抗MRSA菌株。在遺傳距離為0.50時，25株菌被劃分為4個ERIC群和1個獨立成群的菌株。

關鍵詞：雪膽；內生細菌；耐甲氧西林金黃色葡萄球菌；多樣性

中圖分類號：S567.23+9.01文獻標志碼：A文章編號：1002-1302（2014）02-303-03

收稿日期：2013-06-07

基金項目：四川省教育廳科研項目（編號：12ZA240）；樂山師范學院科研項目（編號：Z1160）。

作者簡介：康琳（1990—），女，本科生，從事微生物資源研究。E-mail：947531778@qq.com。

通信作者：龔明福，教授，博士，從事微生物資源及微生物與植物間相互關系研究。E-mail：gongmingfu98@163.com。雪膽（Hemsleya sinesis Cogn.） 為葫蘆科雪膽屬植物，含多種活性成分，具有多種藥理作用，包括抗腫瘤[1]、改善微循環、廣譜抗菌[2]、抗病毒[3]、保護肝臟[4]、治療胃腸疾病[5]、降溫[2]、抗炎鎮咳[6]等作用，被廣泛應用于臨床，是一種具有發展前景的中藥[7]。目前，對雪膽的研究取得了一定進展，如雪膽有效成分的提取工藝、作用機制、檢測方法的建立等。耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA）為醫院內感染的多重耐藥性病原菌[8]，只對萬古霉素敏感[9]，目前幾乎所有國家都已有MRSA的報道，我國各大醫院MRSA的分離率也很高[10]，近年來在全世界蔓延的速度比較快。MRSA除對甲氧西林耐藥外，還對臨床上廣泛應用的多種抗生素耐藥，導致感染呈散發性或暴發性流行，成為全世界范圍抗細菌感染中的難題，已引起醫藥界專家與制藥企業高度關注，因此，解決MRSA耐藥性問題，即研發新的抗MRSA藥物已經成為當今非常重要的任務。根據相似性原理，生活在藥用植物組織中的內生細菌能產生與藥用植物相似的活性成分。劉佳等篩選到1株具有抗MRSA活性的枯草芽孢桿菌，該菌產生的胞外抑菌物質對MRSA具有較好的抑制效果[11]。雪膽抗菌譜廣，其內生細菌具有抗MRSA的潛力，因此從雪膽內生細菌中篩選抗MRSA菌株并通過發酵生產抗MRSA藥物具有重要的意義和發展潛力。

1材料與方法

1.1培養基

NA培養基：牛肉膏5 g、蛋白胨10 g、氯化鈉5 g、瓊脂 18 g、水1 000 mL，pH值 7.2～7.4；PDA培養基：馬鈴薯 200 g、葡萄糖20 g、瓊脂18 g、水1 000 mL，pH值自然，121 ℃滅菌30 min。

1.2雪膽內生細菌的分離純化

從峨眉山采集生長健康的雪膽，從其根莖組織中分離內生細菌。將待分離的新鮮雪膽根莖組織用自來水沖洗干凈，并稱取樣品1 g，先用75%乙醇浸泡消毒5 min，再用2%次氯酸鈉進行表面消毒5 min，最后用無菌水沖洗3～5次；沖洗干凈之后，每種樣品中加入10 mL無菌水，放在無菌研缽中研磨，靜置20 min，取上清液按倍比稀釋法系列稀釋1 000倍后，取梯度稀釋液0.1 mL涂布于平板上，每個處理重復3次，于28 ℃下暗培養72 h；最后一次沖洗的無菌水涂布在NA培養基上，于28 ℃下暗培養72 h，觀察是否有菌落長出，進行無菌檢驗。

等菌落長出后觀察菌落形態和菌體形態（包括大小、形狀、顏色、表面光澤、透明度、質地、革蘭氏染色反應、有無芽孢等），分別挑取不同的菌落，然后在培養基平板上純化，將純化后的內生細菌用相應的培養基斜面及甘油管于4 ℃冰箱內保存備用。

1.3抗MRSA內生細菌的篩選

1.3.1初篩在平板表面涂布MRSA，晾干，取活化的內生細菌菌液一環點接到NA平板上；取無菌水代替內生細菌菌液點接到涂有指示菌MRSA的NA平板上培養，作為空白對照，每個處理重復3次。將平板置于37 ℃培養箱中培養 24 h，測定抑菌圈直徑并記錄試驗結果。

1.3.2復篩在平板表面涂布MRSA，晾干，然后在平板上距離平板中心1.5 cm處放入牛津杯，吸取100 μL初篩的具有抑菌作用的內生細菌發酵液，加入到牛津杯中，用萬古霉素代替內生細菌菌液作為陽性對照，每處理重復3次。將平板置于37 ℃培養箱中培養24 h，測量抑菌圈直徑。

1.4拮抗性雪膽內生細菌ERIC-PCR分析

拮抗性內生細菌基因組總DNA的提取方法參見徐琳等的方法[12]，特異性引物選取ERIC1R（5′-ATGTAAGCTCCCTGGGGATTCAC-3′）和ERIC2L（5′-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3′）[13]，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。反應總體系為25 μL，其組成為 10×Buffer 2.5 μL、25 mmol/μL MgCl2 2.0 μL、2.5 mmol/L dNTP 2.0 μL、20 pmol/μL ERIC1R 0.5 μL、20 pmol/μL ERIC2L 0.5 μL、13 μL ddH2O、模板總DNA（40～80 ng/μL）4.0 μL。ERIC-PCR反應程序參照馬溪平等的方法[13]。反應結束后取出PCR小管，用1%瓊脂糖凝膠電泳3.5 h，利用凝膠成像系統儀拍照并保存圖譜，凝膠圖像經電腦掃描處理后，在同一位置有帶的記為“1”，沒有的記為“0”。采用DPS軟件，用遺傳距離按類平均連鎖聚類法（UPGMA）進行0-1系統聚類分析，得出樹狀圖[14]。

2結果與分析

2.1雪膽內生細菌的分離

將采集到的雪膽進行內生細菌分離，結果發現，在NA平板上長出大量菌落，且菌落形態存在明顯差異，共得到30株內生細菌，依次編號為KLXD01～KLXD30，這表明雪膽組織中存在大量的內生細菌。

2.2抗MRSA內生細菌的篩選

采用平板對峙法初篩、牛津杯法復篩，從所分離到的30株內生細菌中共篩選出25株對MRSA具有抑制效果的菌株（表1），不同細菌菌株的抑菌效果存在明顯差異，KLXD06、KLXD17、KLXD21、KLXD24等4株菌抗MRSA的效果較好，其中KLXD06抗MRSA最大，抑菌圈直徑達19.3 mm。

2.3拮抗性雪膽內生細菌ERIC-PCR分析

對25株拮抗性雪膽內生細菌進行ERIC-PCR擴增，結果表明，供試菌株ERIC-PCR圖譜多呈現3～5條條帶，其分布各不相同，其大小范圍100～1 500 bp（圖1），說明不同菌株在分子水平上存在差異。

用DPS軟件系統采用類平均連鎖法（UPGMA）對這些菌株的ERIC-PCR結果進行聚類分析，得到樹狀圖（圖2）。從圖2可以看出，在遺傳距離為0.71時，所有供試菌株聚在一起；在遺傳距離為0.50時，供試菌株進一步被劃分為4個ERIC群和1個獨立成群的菌株，4個ERIC群分別命名為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ，每個群的菌株數依次為6、8、5、5株，中心菌株分別為KLXD01、KLXD08、KLXD12、KLXD10。

3結論與討論

雪膽植物內生細菌非常豐富，筆者從雪膽中分離到30株內生細菌。ERIC-PCR結果顯示，具有抗MRSA活性的25株菌株在遺傳距離為0.50時被分為4個ERIC群和1個獨立成群。

目前，我國以采用體外抑菌法從中草藥及其提取物中篩

選抗MRSA的物質為主，其中黃岑、黃連等表現出較好的抑菌效果[15-17]，但中草藥成分復雜，分析其抑菌機制比較困難。多株已篩選出的放線菌對MRSA具有較好的抑制效果[11，18-19]。張守村等從苦豆子內生細菌中篩選到1株抗MRSA活性較強的菌株[20]。從其他藥用植物內生細菌中篩選抗MRSA菌株還鮮見報道。雪膽抗菌譜廣，其內生細菌抗MRSA活性強，筆者從雪膽中分離到30株內生細菌，有25株菌株具有較強的抗MRSA活性，其中雪膽內生細菌KLXD06的抗MRSA活性最強，有生產抗MRSA活性藥物的潛力，但該菌株的系統發育地位還需要進一步確定。

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