基于量子點標記技術的雞新城疫病毒sFLISA檢測技術研究

房保海　孫濤　賈俊濤　岳志芹　姜英輝　趙玉然　梁成珠　徐彪

摘要：本研究建立了基于量子點的雞新城疫病毒（NDV） sFLISA檢測方法。該方法以抗NDV多克隆抗體為捕捉抗體、以生物素標記抗NDV單克隆抗體為檢測抗體、以量子點標記的鏈霉親和素為熒光探針。該方法與其它有關禽類病毒（產(chǎn)蛋下降綜合征病毒、雞傳染性法氏囊病病毒、禽白血病病毒）無交叉反應，比血凝試驗靈敏，為臨床早期快速檢測NDV提供了行之有效的方法。

關鍵詞：雞新城疫病毒（NDV）；量子點；雙抗夾心熒光免疫分析（sFLISA）

中圖分類號：S858.31文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2014）05-0118-04

新城疫是由新城疫病毒（Newcastal disease virus，NDV）引起的急性、高度接觸性傳染病，常呈敗血癥，主要特征是呼吸困難、下痢、神經(jīng)機能紊亂、黏膜和漿膜出血，嚴重危及禽類養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，現(xiàn)流行于世界各國[1～3]。新城疫被國際獸疫局（OIE）定為A類傳染病，中國將其列為一類動物疫病[4]。

新城疫病毒的檢測主要應用免疫方法（包括免疫傳感技術、蛋白質(zhì)芯片技術、膠體金免疫層析技術、免疫組化技術、免疫熒光技術等）和分子生物學技術（包括RT-PCR技術、基因芯片、液相芯片技術等）[5]。量子點（Quantum dots，QDs）是近年發(fā)展起來的一種新型熒光納米材料，與傳統(tǒng)有機熒光染料相比，具有熒光穩(wěn)定性高、吸收光譜寬、發(fā)射光譜窄而對稱、衰減壽命長、生物相容性好等特點，已經(jīng)成為病原檢測的新工具[6～9]。

本研究以抗NDV多克隆抗體為捕捉抗體，以生物素標記抗NDV單克隆抗體為檢測抗體，以量子點標記的鏈霉親和素為熒光探針，建立了NDV sFLISA檢測方法，為養(yǎng)殖業(yè)早期發(fā)現(xiàn)NDV感染提供了有力的工具。

1材料與方法

1.1試驗材料

滅活新城疫病毒（NDV，HA效價為256）和陽性尿囊液病毒由本試驗室保存。雞產(chǎn)蛋下降綜合征病毒、雞傳染性法氏囊病病毒、禽白血病病毒抗原、雞新城疫病毒（La Sota株）國家參考品、抗雞新城疫病毒陽性血清和雞新城疫試驗用陰性血清購自國家獸醫(yī)微生物菌種保藏中心。

1.2主要試劑和抗體

兔抗NDV多克隆抗體（GLOBAL BIOTECH，1 μg/μL）；鼠抗NDV單克隆抗體（GLOBAL BIOTECH，1 μg/μL）；量子點標記的鏈霉親和素-605（QS605，武漢珈源量子點技術開發(fā)有限公司）；包被液：0.05 mol/L碳酸鹽緩沖液（pH 9.6）；洗滌液：0.5% Tween-20的磷酸鹽緩沖液（PBS）；封閉液：1× BSA-PBS。

1.3主要儀器和器材

多功能熒光酶標儀（SpectraMax M5）；6930型冷凍離心機（日本KUBOTA公司）；5415R 微量冷凍離心機（德國Eppendorf 公司）；MS3渦流旋轉振蕩儀（德國IKA公司）；黑色底透的熒光酶標板（Thermofisher NUNC）；Eppendorf移液槍（0～200 μL、0～1000 μL，德國Eppendorf 公司）；冰箱[冷藏溫度（4±1）℃，中國海爾]；恒溫培養(yǎng)箱[（37±1）℃、（42±1）℃，日本SANYO]。

1.4尿囊液病毒的制備

4℃反復凍融尿囊液3次，然后3 000、5 000、8 000 r/min 各離心30 min，上清經(jīng)100 000×g離心2 h，用少量 TEN 緩沖液將病毒沉淀懸浮，再用20%～60%的蔗糖溶液經(jīng)密度梯度離心純化，經(jīng)100 000×g 離心8 h，收集40%～60%梯度層內(nèi)的病毒帶，用pH 7.4、0.01 mol/L PBS 透析48 h，分裝，于-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 sFLISA標準操作程序

sFLISA在NUNC酶標板反應微孔中完成，具體實驗方法如圖1所示。微孔板先用100 μL含有1.25 μg/mL的抗NDV多克隆抗體在4 ℃包被過夜（包被液：0.05 mol/L、pH9.6的碳酸鹽緩沖液）；洗滌液洗滌3次，200 μL/孔，每次3 min；用1×BSA-PBS封閉，300 μL/孔，37℃ 封閉2 h；洗滌液洗板3次后，加入待測樣品，100 μL/孔，37℃孵育1 h；洗板后加入1∶200稀釋的生物素標記NDV單克隆抗體，100 μL/孔，37℃孵育1 h；洗板后加入量子點標記的鏈霉親和素熒光探針，37℃孵育1 h，洗板后晾干。陰性對照孔加陰性血清，空白對照孔加入100 μL PBS，通過熒光分光光度計測定其相對熒光強度。

1.6sFLISA工作條件的優(yōu)化

1.6.1多抗包被濃度、生物素標記單克隆抗體稀釋度的確定抗NDV多克隆抗體以10、5、2.5、1.25 μg/mL和0.625 μg/mL等5個稀釋濃度各100 μL豎排包被聚苯乙烯板，4℃過夜；洗滌封閉后加入標準抗原NDV，100 μL/孔，固定標準抗原NDV濃度；洗滌拍干，生物素標記抗NDV單克隆抗體以1∶200、1∶400、1∶800共3個稀釋濃度各100 μL反應，37℃作用1 h；洗滌拍干，加入1∶100稀釋的量子點標記的鏈霉親和素，37℃作用1 h，洗滌拍干后在多功能酶標儀上用390 nm的激發(fā)波長、605 nm的發(fā)射波長讀取相對熒光強度（RFU）值。根據(jù)P/N比值，以確定包被抗體和生物素標記抗體的最佳濃度。

1.6.2量子點標記的鏈霉親和素稀釋倍數(shù)的優(yōu)化以NDV包被酶標板，生物素標記抗體按1∶200稀釋作為檢測抗體，量子點標記的鏈霉親和素分別按照1∶50、1∶100、1∶200稀釋，100 μL/孔加入，37 ℃作用1 h，洗滌拍干后在多功能酶標儀上用390 nm的激發(fā)波長、605 nm的發(fā)射波長讀取相對熒光強度（RFU）值。根據(jù)P/N比值，以確定量子點標記的鏈霉親和素稀釋倍數(shù)。endprint

1.7陰陽性判定標準的確定

采用建立的sFLISA方法進行12次陰性對照檢測，計算相對熒光單位RFU的平均值（X）和標準差（SD），陽性臨界值=陰性樣品的X+3SD。檢測時，當樣品RFU>陽性臨界值，判斷為陽性。

1.8sFLISA敏感度檢測

確定單抗和多抗的最佳工作濃度，將純化的尿囊液病毒在1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶320、1∶640、1∶1280等8個稀釋度進行測定，同時進行原倍毒液試驗，設陰性和空白對照。

1.9sFLISA特異性試驗

用建立的檢測方法對NDV、雞產(chǎn)蛋下降綜合征病毒、雞傳染性法氏囊病病毒、禽白血病病毒抗原、雞新城疫病毒（La Sota株）國家參考品進行檢測，確定所建立檢測方法的特異性。

1.10重復性試驗

在同一個酶標板內(nèi)檢測NDV、NDV國家標準品和尿囊液制備的NDV，每樣重復3次；選取3塊不同酶標板，每個板重復3孔，按1.5的步驟進行sFLISA，分別計算樣品的板內(nèi)和板間變異系數(shù)（CV）。

1.11阻斷試驗

將陽性NDV用滅菌生理鹽水按1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶320稀釋后，50 μL分別加入等量的標準陽性血清（1∶10稀釋），37℃作用1 h，10 000 r/min離心，取上清進行檢測，以NDV為陽性對照。

2結果與分析

2.1包被多克隆抗體與生物素標記抗體稀釋度的確定

包被抗體分別以10、5、2.5、1.25 μg/mL和0.625 μg/mL進行包被，生物素標記抗體分別進行1∶200、1∶400、1∶800的稀釋，量子點標記的鏈霉親和素以1∶100的稀釋度進行偶聯(lián)。結果表明，包被抗體單抗為1.25 μg/mL，生物素標記的檢測抗體1∶200時，其P/N值最大，為56.028。因此，選擇1.25 μg/mL作為包被抗體的濃度，1∶200 作為生物素標記抗體的最佳稀釋度（見表1）。

2.2量子點標記的鏈霉親和素稀釋倍數(shù)優(yōu)化

以上述優(yōu)化的條件，即包被抗體濃度為1.25 μg/mL，生物素標記的檢測抗體稀釋倍數(shù)為1∶200，對量子點標記的鏈霉親和素稀釋倍數(shù)進行優(yōu)化。結果（表2）表明，在1∶100時，P/N值為61.453，最大，故選擇此稀釋倍數(shù)為最優(yōu)稀釋倍數(shù)。

2.3 sFLISA陰陽性界限的確定

在上述優(yōu)化的反應參數(shù)條件下，進行12次陰性血清sFLISA試驗，得到陰性試驗平均值為0.361，標準差為0.037，X+3SD =0.472，從而確定RFU 值在0.472及以上為陽性，RFU值在0.361～0.471之間為疑似，RFU值在0.361以下為陰性（表3）。

2.4 敏感性分析

將制備好的尿囊液NDV以1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶320、1∶640、1∶1 280等8個稀釋度稀釋，按照優(yōu)化sFLSA的條件檢測結果表明，隨著病毒含量的降低，其RFU 值呈下降趨勢，但當病毒1∶640 稀釋時，結果仍為陽性（RFU值為0.725），表明該方法靈敏度較好。

2.5 特異性試驗

在已優(yōu)化的sFLISA反應條件的基礎上，對雞產(chǎn)蛋下降綜合征病毒、雞傳染性法氏囊病病毒、禽白血病病毒抗原、雞新城疫病毒（La Sota株）國家參考品進行了檢測，結果只有雞新城疫病毒（La Sota株）國家參考品為陽性，其它病毒均為陰性，表明本方法具有較好的特異性（表5）。

2.6重復性試驗

在同一酶標板內(nèi)，對NDV、NDV國家標準品和尿囊液制備的病毒進行板內(nèi)重復性試驗，每份樣品重復3次。重復性分析結果顯示：板內(nèi)變異系數(shù)為1.5%～4.1%，板間變異系數(shù)為1.5%～3.0%（表6），變異程度很小，均小于10%，表明該方法具有較好的重復性。

2.7阻斷試驗

結果表明（表7），經(jīng)稀釋的NDV作為被檢材料，標準陽性血清能特異性地阻斷NDV與包被抗體的結合，病毒1∶40稀釋后檢測結果呈陰性。

量子點作為一種新型的熒光探針，被越來越多地應用到病原生物檢測中[8]，但應用于動物病毒檢測的研究較少。本研究應用量子點標記的鏈霉親和素作為熒光探針、生物素標記單克隆抗體作為檢測抗體，通過生物素-親和素之間的特異性互作，建立了一種基于量子點熒光探針的NDV sFLISA檢測方法。通過對已知陽性樣品的比較測定，陽性樣品稀釋至640倍還能檢出；與其它有關禽類病毒無交叉反應（產(chǎn)蛋下降綜合征病毒、雞傳染性法氏囊病病毒、禽白血病病毒抗原），說明此檢測方法對NDV特異性較強，靈敏度高。該方法的建立為NDV的監(jiān)測和診斷提供了新方法，在進出口檢疫上也將發(fā)揮良好的作用。

參考文獻：

[1]包紅梅， 田國彬， 陳化蘭，等. 禽流感的診斷技術與防制措施[J]. 中國獸醫(yī)科技， 2003（33）：75-79.

[2]陳創(chuàng)， 陳良冬， 張志凌，等. 量子點在腫瘤標志物研究中的應用進展[J]. 中國癌癥雜志， 2007（17）：813-818.

[3]魏祥法， 劉輝， 井慶川，等. 抗雞新城疫、傳染性法氏囊病免疫球蛋白的研究[J]. 山東農(nóng)業(yè)科學， 2007（2）：97-98.

[4]陳宏偉， 劉紅莉， 王一理，等. 量子點：新的熒光標記物質(zhì)[J]. 中華病理學雜志， 2005，34（1）：47-49.

[5]杜景嬌， 薛強， 鄒明強，等. 新城疫檢測技術的研究新進展[J]. 中國畜牧獸醫(yī)， 2012， 39（2）： 187-191.

[6]Murphy C J. Optical sensing with quantum dots[J]. Analytical Chemistry， 2002， 74： 520-526.

[7]Niemeyer C M. Nanoparticles， proteins， and nucleic acids： biotechnology meets materials science[J]. Angew.Chem .Int. Edn. Eng.，2001， 40： 4128-4158.

[8]Alivisatos P. The use of nanocrystals in biological detection[J]. Nature Biotechnol.， 2004， 22（1）： 47-52.

[9]Akerman M E， Chan W C W， Laakkonen P， et al. Nanocrystal targeting in vivo[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 2002， 99（20）： 12617-12621.

[10]陳偉， 沈鶴柏， 陳艷，等.新型熒光物質(zhì)——量子點在生命科學領域的應用研究進展[J]. 化學通報， 2007（6）：403-408.山 東 農(nóng) 業(yè) 科 學2014，46（5）：122～126Shandong Agricultural Sciences山 東 農(nóng) 業(yè) 科 學第46卷第5期范珺，等：endprint