大豆子葉節遺傳轉化受體體系的建立

曲靜　劉思言　姚丹　淑艷　丕武　佳鑫

摘要：以3個大豆品種為試材，研究了種子消毒方法、叢生芽誘導和生根階段不同的激素濃度對大豆子葉節再生的影響，以求建立一個高效的再生體系用于大豆的遺傳轉化。結果表明，大豆種子消毒的最佳方法為：70%酒精消毒30 s后，HgCl2消毒7 min，無菌水清洗3～5次。吉農28的最佳叢生芽誘導培養基為MS+1.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L IBA；而對于吉農27和九農21，MS+2.0 mg/L 6-BA+0.8 mg/L IBA為最佳叢生芽培養基。在叢生芽誘導生根階段，三種不同的基因型最佳的生根培養基均為1/2MS+2.0 mg/L IBA。

關鍵詞：大豆；激素；叢生芽誘導；生根

中圖分類號：S565.104.3文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2014）05-0026-03

大豆（Glycine max L.）既是糧食作物，又是油料和飼料作物。自1988年Hinchee等[1]和McCabe等[2]獲得轉基因大豆植株以來，國內外學者開展了大量的大豆遺傳轉化研究工作，并取得一些突破性進展。以大豆無菌苗子葉節、莖尖、初生葉節、未成熟子葉、上胚軸和下胚軸等為外植體都獲得了再生植株[2～9]。目前大豆的遺傳轉化多數以子葉節再生體系作為受體系統，但子葉節再生體系也存在諸如叢生芽少、不易伸長等缺點。因此迄今為止，大豆仍是公認的難轉化的植物之一。

大豆子葉節穩定高效遺傳轉化受體體系的建立是提高大豆遺傳轉化效率的基礎。本試驗旨在篩選大豆種子消毒的最佳方法以及叢生芽誘導和生根的最佳培養基，完善目前大豆子葉節遺傳轉化受體體系，獲得高效的再生體系，為轉基因大豆的研究奠定基礎。

1材料與方法

1.1試驗材料

供試材料為吉農28、九農21、吉農27三個大豆品種，均由吉林農業大學農學院副教授張君提供。

1.2試驗方法

1.2.1種子消毒方法的研究選擇健康飽滿的大豆種子，自來水清洗干凈，70%的酒精表面消毒30 s，采用三種不同的消毒方法對大豆種子進行消毒：①用6% NaClO進行消毒，消毒時間分別為12、15、18 min；②用0.1% HgCl2進行消毒，消毒時間分別為5、7、9 min；③用6% NaClO + 20% HCl進行消毒，消毒時間分別為120、240、360 min。然后用無菌水清洗3～5次，接種到MS培養基上，5 d后統計發芽率及污染率。

1.2.2叢生芽誘導培養基激素濃度篩選大豆種子萌發培養5～6 d后，取出萌發的種子，剝去種皮，保留2～3 mm下胚軸，將子葉從下胚軸處切開，除去頂芽及腋芽，置于不同的叢生芽誘導培養基上。芽誘導培養基分別為：①MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IBA；②MS+1.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L IBA；③MS+2.0 mg/L 6-BA+0.8 mg/L IBA；④MS+2.5 mg/L 6-BA+1.0 mg/L IBA。每個三角瓶約3～4個子葉節，于26℃、光照條件下培養，2周后對叢生芽誘導的情況進行統計分析。

1.2.3叢生芽生根培養基激素濃度篩選將分化出的叢生芽切下，以每瓶5個外植體接種于叢生芽生根培養基上，生根培養基以1/2MS為基本培養基，IBA濃度分別為0、0.5、1.0、1.5、2.0 mg/L，培養15 d，重復3次。培養條件與叢生芽誘導培養條件相同，每2天觀察一次，記錄生根的快慢、根形、生根率，篩選最佳濃度。

2結果與分析

2.1不同消毒方法消毒效果比較

以NaClO作為消毒劑時，種子發芽大多受到抑制，發芽率極低，可能是因為消毒劑滲透到浸泡之后的種子內部，對其造成了嚴重傷害。HgCl2和NaClO+HCl處理的種子萌發速度一致，2 d之后開始萌發，發芽率也一致，從試驗操作的簡便性方面考慮應選擇HgCl2。在消毒時間方面可以看出7 min為最佳消毒時間，污染率為零（表1）。因此，HgCl2消毒7 min為最佳消毒方法。

2.2不同激素配比對叢生芽誘導的影響

接種約1周后，可見子葉節處有小芽長出，2周后對叢生芽誘導情況進行統計，結果見表2。可以看出，吉農28在激素濃度為1.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L IBA時的誘導率最高，達到89%；九農21在激素濃度為2.0 mg/L 6-BA+0.8 mg/L IBA時的誘導率最高，達到91%；吉農27在激素濃度為2.0 mg/L 6-BA+0.8 mg/L IBA時的誘導率最高，達到94%。

2.3不同IBA濃度對叢生芽生根的影響

大豆叢生芽誘導生根常采用的植物生長調節劑為IBA，這已被大多數研究者認同，本試驗結果（表3）顯示，三種基因型的大豆生根的最佳培養基均為1/2 MS + 2.0 mg/L IBA。

3結論與討論

種子的消毒處理是建立大豆子葉節高效再生體系的前提和基礎，消毒徹底的同時又要盡可能減少對種子的傷害。消毒時間長，可降低污染率，但對種子傷害較大，進而影響了種子的萌發。本試驗結果顯示，用0.1% HgCl2消毒種子7、9 min的污染率均為零，發芽率比消毒5 min低，這與曲桂芹教授研究的影響大豆體細胞胚誘導因素的結果一致[10]。

本試驗研究結果表明，大豆種子消毒的最佳方法為70%酒精消毒30 s后，HgCl2消毒7 min，再用無菌水清洗3～5次。不同品種對叢生芽誘導培養基的要求存在差異，吉農28的最佳叢生芽誘導培養基為MS+1.5 mg/L 6-BA + 0.5 mg/L IBA；而吉農27、九農21的最佳培養基為MS+2.0 mg/L 6-BA + 0.8 mg/L IBA。在叢生芽誘導生根階段，吉農28、吉農27、九農21的最佳生根培養基均為1/2 MS + 2.0 mg/L IBA。

外植體褐變是組織培養過程中常見的現象，為避免因外植體褐變造成培養材料的損失，本試驗在子葉節外植體接種后，將外植體每隔7 d向新鮮培養基中轉移一次，以減輕褐變造成的影響。同時在培養基中添加適量VC來減少褐變發生，效果比較理想。

參考文獻：

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[10]曲桂芹，張賢澤，霍俊偉. 影響大豆體細胞胚誘導因素的研究[J].植物研究，2001，21（2）：210-215.

外植體褐變是組織培養過程中常見的現象，為避免因外植體褐變造成培養材料的損失，本試驗在子葉節外植體接種后，將外植體每隔7 d向新鮮培養基中轉移一次，以減輕褐變造成的影響。同時在培養基中添加適量VC來減少褐變發生，效果比較理想。

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外植體褐變是組織培養過程中常見的現象，為避免因外植體褐變造成培養材料的損失，本試驗在子葉節外植體接種后，將外植體每隔7 d向新鮮培養基中轉移一次，以減輕褐變造成的影響。同時在培養基中添加適量VC來減少褐變發生，效果比較理想。

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