野葛藤地上部分揮發油成分分析和抗氧化活性研究

仰玲玲+吳向陽+仰榴青

摘要：對茅山地區野葛藤的揮發成分進行了初步分析和抗氧化活性研究，采用水蒸氣蒸餾-乙醚萃取法對野葛藤進行提取，用GC/MS對其揮發成分進行初步分析，并用DPPH法、鄰二氮菲法和鄰苯三酚自氧化法研究了葛藤揮發油清除自由基活性。得出結果：葛藤分離出的153個組分中可鑒定組分64個，其中主要以烷酸和烯酸類化合物為主；且揮發油都具有良好的清除自由基活性。

關鍵詞：野葛藤； 揮發油； 水蒸氣蒸餾-乙醚萃取法； GC/MS； 抗氧化活性

中圖分類號： R284.1文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2014）02-0268-04

收稿日期：2013-07-07

作者簡介：仰玲玲（1983—），女，安徽巢湖人，碩士，講師，主要從事食品工藝與檢測。E-mail：foodwhat605b@aliyun.com。

通信作者：吳向陽，博士，教授，主要從事生物資源高效利用研究。E-mail：wuxy@ujs.edu.cn。野葛[Puerariae lobata （Wild） Ohwi]為豆科多年生落葉藤本植物，廣泛分布在茅山地區。中國藥典收載的葛根系野葛的干燥根，其藥用最早記載于《神農本草經》。現代藥理研究證實，葛根具有顯著的擴張冠狀動脈、增加冠脈血流量、降低血壓及血管阻力、抗心律失常、抗氧化作用、提高學習記憶功能等多種藥理作用[1]。另外，近年來研究發現野葛的其他部位，如葛藤（葛藤莖和葛葉）、葛花，也具有類似的藥理活性。目前我國野葛的研究和開發都集中在葛根與葛花[2]部位，而對葛藤部位的分析主要為異黃酮類成分，對其他化學成分的分析以及生物活性的研究少。本研究分別利用水蒸氣蒸餾-乙醚萃取法對野葛藤進行提取，并對所得成分進行初步分析和抗氧化活性研究，以期為葛藤的開發利用提供科學依據。

1材料與方法

1.1主要材料與試劑

野葛藤樣品，2007年10月采集于江蘇省茅山地區，60 ℃烘干，粉碎，過60目篩，貯存于干燥器中備用。5%苯酚溶液的配制：取苯酚100 g，加鋁片0.1 g和碳酸氫鈉0.05 g，蒸餾，收集182℃餾分，稱取10 g，加水溶解并稀釋至200.0 mL，搖勻，置棕色瓶內，放冰箱中備用。

1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH·）（美國Sigma公司）；鄰二氮菲和苯丙三酚（國藥集團化學試劑有限公司）；95%醫用乙醇；其余試劑均為分析純；所有用水均為雙蒸水。

1.2主要儀器與設備

氣相色譜-質譜聯用儀，配有6890N 色譜儀、5975B VL MSD和HP7683全自動進樣器（美國Agilent公司）；電子天平（北京賽多利斯儀器系統有限公司）；旋轉蒸發儀RE-52C（鞏義市予華儀器有限責任公司）。

1.3試驗方法

1.3.1葛藤揮發油的提取準確稱取葛藤莖葉50 g，置于 2 000 mL 圓底蒸餾燒瓶中，加入500 mL蒸餾水，用揮發油提取器進行提取，時間為12 h，蒸出液用乙醚萃取，無水硫酸鈉干燥，過濾，乙醚自然揮發干，得到金黃色揮發油0.2011 g。

1.3.2揮發油成分分析

1.3.2.1供試樣品的制備 取一定量的揮發油，加入甲酯化試劑（10 mL濃H2SO4緩慢倒入90 mL CH3OH中，攪勻，待冷卻加入100 mL苯）3.0 mL，室溫下反應24 h；加入1.0 mL苯和0.5 mL飽和NaCl溶液，充分攪拌，離心5 min，靜置，取上清液備用。

1.3.2.2GC-MS分析條件氣相色譜條件：DB-1石英毛細管柱（30 m×0.25 mm，膜厚0. 25 μm）；載氣He，載氣流量1.50 mL/ min；柱溫75～220 ℃；程序升溫：初始溫度為 75 ℃，保持3 min后以8 ℃/min的速率升至220 ℃，保持 5 min；氣化室溫為260 ℃；分流比為25 ∶1。質譜條件：EI離子源；離子源溫度230 ℃；電子能量70 eV；接口溫度250 ℃；質量掃描范圍35～540 u。

1.3.3 抗氧化活性試驗

1.3.3.1 清除DPPH·自由基試驗[3-4]利用分光光度法測定DPPH·的清除率，測定波長為524 nm。分別取2 mL不同濃度的以80%乙醇為溶劑的樣品液于試管中，加入2 mL 0.2 mmol/L 的DPPH·溶液（以無水乙醇配制），混合均勻，暗處反應30 min后于524 nm處測定其吸光度D524 nm，以溶劑80%乙醇代替樣品液測得空白吸光度D0，重復3次。清除率按下式計算：

清除率S=（D0-D524 nm）/D0×100%

1.3.3.2清除羥自由基（·OH）試驗[5]取1 mL 0.75 mmol/L 鄰二氮菲無水乙醇溶液于試管中，依次加入 2 mL 0.2 mol/L pH值7.40磷酸鹽緩沖溶液和1 L蒸餾水，充分混勻后，加入1 mL 0.75 mmol/L硫酸亞鐵溶液（FeSO4）混勻，再加入1 mL 0.01%雙氧水（H2O2），于37 ℃水浴60 min，在536 nm處測其吸光度，所測得的數據為損傷管的吸光度D損；以1 mL樣品液代替1 mL蒸餾水測得樣品的吸光度D樣；用1 mL蒸餾水代替1 mL雙氧水測得的吸光度為D未。重復3次。清除率按下式計算：

清除率S=（D樣-D損）/（D未-D損） ×100%

1.3.3.3清除超氧自由基（ O-2· ）試驗[6]取9 mL 0.01 mol/L 磷酸鹽緩沖液（pH值8.2）與1 mL樣品液混合，25 ℃ 恒溫水浴15 min。取3 mL混合液于比色皿中，加入 0.1 mL 的45 mmol/L鄰苯三酚，搖勻，在第4分鐘加入 10 mol/L 鹽酸1滴終止反應，于325 nm處測定樣品吸光度D1，同時分別測定不加鄰苯三酚的樣品液和磷酸鹽混合液的吸光度D2和以1 mL溶劑代替樣品液的磷酸鹽和鄰苯三酚混合液的吸光度D3，重復3次。 O-2· 清除率按下式計算：endprint

清除率S=[1-（D1-D2）/D3] ×100%

2結果與分析

2.1葛藤揮發油成分分析

用水蒸氣蒸餾法提取葛藤揮發油201.1 mg，出油率為0402%。利用毛細管色譜對其揮發油成分進行了分析，化學工作站給出總離子流色譜圖（圖1）。利用氣-質聯用技術對它進行總離子質譜檢測，采用計算機對各峰質譜圖進行標準譜庫的檢索并結合質譜裂解規律，從153個峰中鑒定出64個組分，占揮發油總量的91.17%。利用峰面積歸一化計算各組分的相對含量。分析鑒定結果見表1。

從表1可知，成功鑒定出的64種化合物中：醇類化合物（7個，見表1中序號14、22、44、54、55、58、60）占總量的522%；酮類化合物（2個，見表1中序號25、38）占4.41%；烯烴類化合物（3個，見表1中序號22、34、57）占0.65%；烷烴類化合物（3個，見表1中序號7、10、21）占0.12%；醛類化合物（6個，見表1中序號2、8、11、13、15、59）占0.32%；烷酸和烯酸類化合物（31個，烷酸見表1中序號1、6、9、12、16、19、23、28～31、35、36～37、41～43、46～47、49、53、61，烯酸見表1中序號3、27、40、48、52～53、56、62～63）占69.72%；芳烴類化合物（4個，見表1中序號5、18、20、50）占0.65%；酯類化合物（5個，見表1中序號4、17、33、45、64）占3.55%；其他化合物（1個，見表1中序號39）占1.35%。

從分析結果可以看出，葛藤揮發油中主要化學成分為： 2-甲基-Z，Z-3，13-十八碳二烯醇，植酮、壬二酸、十二烷酸、肉豆蔻酸、十五烷酸、十六烷酸、十七烷酸、十八烷酸、（Z）-9-十八烯酸、10，13-十六二烯酸、11-十八碳烯酸、8-（2-呋喃）辛酸酯、2-戊酸十四酯、9-十八炔，其中主要以烷酸和烯酸類化合物為主。

2.2抗氧化活性試驗

2.2.1清除DPPH·自由基效果圖2和圖3分別為揮發油和維生素C對DPPH·的清除效果。可以看出，揮發油對DPPH·具有清除作用，清除率隨著提取物濃度的增加而增大。揮發油對DPPH·自由基的半清除率（IC50）值為 3.3011 mg/mL，其清除DPPH·能力弱于維生素C（0.009 1 mg/mL）。

2.2.2清除羥基自由基（·OH）效果圖4和圖5分別為揮發油和維生素C對·OH的清除效果。可以看出，揮發油對·OH有一定的清除作用，且清除率隨著濃度的增加而增大，當濃度為4 mg/mL時，揮發油的清除率為72.48%。揮發油對·OH自由基的半清除率IC50值為3.075 5 mg/mL，其清除·OH能力弱于維生素C（0.347 7 mg/mL）。

2.2.3清除超氧自由基（ O-2· ）效果圖6和圖7分別為揮發油和維素C對 O-2· 的清除效果，可見揮發油在3 mg/mL的清除率達到64.39%。揮發油的IC50值為2.342 4 mg/mL，其清除率低于維素C（0.229 9 mg/mL）。

3討論與結論

采用硫酸催化甲酯化衍生化方法，對野葛藤揮發油進行了GC-MS分析，鑒定出64種化合物，其中醇類化合物（7個）占總量的5.22%；酮類化合物（2個）占4.41%；烯烴類化合物（3個）占0.65%；烷烴類化合物（3個）占0.12%；

醛類化合物（6個）占0.32%；酸類化合物（31個）占6972%；芳烴類化合物（4個）占0.65%；酯類化合物（4個）占3.55%；其他化合物（1個）占1.35%。

本研究通過清除DPPH·自由基能力、清除羥自由基能力、清除超氧陰離子能力3個方面試驗，并與維生素C進行比較，得出較為客觀的結論：野葛藤揮發油對3種自由基（DPPH·、·OH、 O-2· ）均有較好的清除作用，可開發為天然抗氧化劑。

參考文獻：

[1]趙亮，潘顯道，朱承根. 葛根黃酮的研究進展[J]. 醫學研究通訊，2004，33（11）：33-35.

[2]周艷暉，岑穎洲，李藥蘭，等. 廣東連南地區野葛花揮發油成分的GC-MS分析[J]. 暨南大學學報：自然科學與醫學版，2004，25（3）：381-385.

[3]Liyana-Pathirana C M，Shahidi F. Antioxidant and free radical scavenging activities of whole wheat and milling fractions[J]. Food Chemistry，2007，101（3）： 1151-1157.

[4]許申鴻，杭瑚. 葡萄籽和葡萄片清除自由基作用的研究[J]. 食品科學，1999（12）：28-30.

[5]于立梅，趙謀明，崔春，等. 山竹殼中原花青素提取分級及抗氧化活性的研究[J]. 食品與機械，2007，23（4）：60-64.

[6]Ouettier-Deleu C，Gressier B，Vasseur J，et al. Phenolic compounds and antioxidant activities of buckwheat（Fagopyrum esculentum Moench） hulls and flour[J]. Journal of Ethnopharmacology，2000，72（1/2）： 35-42.endprint

清除率S=[1-（D1-D2）/D3] ×100%

2結果與分析

2.1葛藤揮發油成分分析

用水蒸氣蒸餾法提取葛藤揮發油201.1 mg，出油率為0402%。利用毛細管色譜對其揮發油成分進行了分析，化學工作站給出總離子流色譜圖（圖1）。利用氣-質聯用技術對它進行總離子質譜檢測，采用計算機對各峰質譜圖進行標準譜庫的檢索并結合質譜裂解規律，從153個峰中鑒定出64個組分，占揮發油總量的91.17%。利用峰面積歸一化計算各組分的相對含量。分析鑒定結果見表1。

從表1可知，成功鑒定出的64種化合物中：醇類化合物（7個，見表1中序號14、22、44、54、55、58、60）占總量的522%；酮類化合物（2個，見表1中序號25、38）占4.41%；烯烴類化合物（3個，見表1中序號22、34、57）占0.65%；烷烴類化合物（3個，見表1中序號7、10、21）占0.12%；醛類化合物（6個，見表1中序號2、8、11、13、15、59）占0.32%；烷酸和烯酸類化合物（31個，烷酸見表1中序號1、6、9、12、16、19、23、28～31、35、36～37、41～43、46～47、49、53、61，烯酸見表1中序號3、27、40、48、52～53、56、62～63）占69.72%；芳烴類化合物（4個，見表1中序號5、18、20、50）占0.65%；酯類化合物（5個，見表1中序號4、17、33、45、64）占3.55%；其他化合物（1個，見表1中序號39）占1.35%。

從分析結果可以看出，葛藤揮發油中主要化學成分為： 2-甲基-Z，Z-3，13-十八碳二烯醇，植酮、壬二酸、十二烷酸、肉豆蔻酸、十五烷酸、十六烷酸、十七烷酸、十八烷酸、（Z）-9-十八烯酸、10，13-十六二烯酸、11-十八碳烯酸、8-（2-呋喃）辛酸酯、2-戊酸十四酯、9-十八炔，其中主要以烷酸和烯酸類化合物為主。

2.2抗氧化活性試驗

2.2.1清除DPPH·自由基效果圖2和圖3分別為揮發油和維生素C對DPPH·的清除效果。可以看出，揮發油對DPPH·具有清除作用，清除率隨著提取物濃度的增加而增大。揮發油對DPPH·自由基的半清除率（IC50）值為 3.3011 mg/mL，其清除DPPH·能力弱于維生素C（0.009 1 mg/mL）。

2.2.2清除羥基自由基（·OH）效果圖4和圖5分別為揮發油和維生素C對·OH的清除效果。可以看出，揮發油對·OH有一定的清除作用，且清除率隨著濃度的增加而增大，當濃度為4 mg/mL時，揮發油的清除率為72.48%。揮發油對·OH自由基的半清除率IC50值為3.075 5 mg/mL，其清除·OH能力弱于維生素C（0.347 7 mg/mL）。

2.2.3清除超氧自由基（ O-2· ）效果圖6和圖7分別為揮發油和維素C對 O-2· 的清除效果，可見揮發油在3 mg/mL的清除率達到64.39%。揮發油的IC50值為2.342 4 mg/mL，其清除率低于維素C（0.229 9 mg/mL）。

3討論與結論

采用硫酸催化甲酯化衍生化方法，對野葛藤揮發油進行了GC-MS分析，鑒定出64種化合物，其中醇類化合物（7個）占總量的5.22%；酮類化合物（2個）占4.41%；烯烴類化合物（3個）占0.65%；烷烴類化合物（3個）占0.12%；

醛類化合物（6個）占0.32%；酸類化合物（31個）占6972%；芳烴類化合物（4個）占0.65%；酯類化合物（4個）占3.55%；其他化合物（1個）占1.35%。

本研究通過清除DPPH·自由基能力、清除羥自由基能力、清除超氧陰離子能力3個方面試驗，并與維生素C進行比較，得出較為客觀的結論：野葛藤揮發油對3種自由基（DPPH·、·OH、 O-2· ）均有較好的清除作用，可開發為天然抗氧化劑。

參考文獻：

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[6]Ouettier-Deleu C，Gressier B，Vasseur J，et al. Phenolic compounds and antioxidant activities of buckwheat（Fagopyrum esculentum Moench） hulls and flour[J]. Journal of Ethnopharmacology，2000，72（1/2）： 35-42.endprint

清除率S=[1-（D1-D2）/D3] ×100%

2結果與分析

2.1葛藤揮發油成分分析

用水蒸氣蒸餾法提取葛藤揮發油201.1 mg，出油率為0402%。利用毛細管色譜對其揮發油成分進行了分析，化學工作站給出總離子流色譜圖（圖1）。利用氣-質聯用技術對它進行總離子質譜檢測，采用計算機對各峰質譜圖進行標準譜庫的檢索并結合質譜裂解規律，從153個峰中鑒定出64個組分，占揮發油總量的91.17%。利用峰面積歸一化計算各組分的相對含量。分析鑒定結果見表1。

從表1可知，成功鑒定出的64種化合物中：醇類化合物（7個，見表1中序號14、22、44、54、55、58、60）占總量的522%；酮類化合物（2個，見表1中序號25、38）占4.41%；烯烴類化合物（3個，見表1中序號22、34、57）占0.65%；烷烴類化合物（3個，見表1中序號7、10、21）占0.12%；醛類化合物（6個，見表1中序號2、8、11、13、15、59）占0.32%；烷酸和烯酸類化合物（31個，烷酸見表1中序號1、6、9、12、16、19、23、28～31、35、36～37、41～43、46～47、49、53、61，烯酸見表1中序號3、27、40、48、52～53、56、62～63）占69.72%；芳烴類化合物（4個，見表1中序號5、18、20、50）占0.65%；酯類化合物（5個，見表1中序號4、17、33、45、64）占3.55%；其他化合物（1個，見表1中序號39）占1.35%。

從分析結果可以看出，葛藤揮發油中主要化學成分為： 2-甲基-Z，Z-3，13-十八碳二烯醇，植酮、壬二酸、十二烷酸、肉豆蔻酸、十五烷酸、十六烷酸、十七烷酸、十八烷酸、（Z）-9-十八烯酸、10，13-十六二烯酸、11-十八碳烯酸、8-（2-呋喃）辛酸酯、2-戊酸十四酯、9-十八炔，其中主要以烷酸和烯酸類化合物為主。

2.2抗氧化活性試驗

2.2.1清除DPPH·自由基效果圖2和圖3分別為揮發油和維生素C對DPPH·的清除效果。可以看出，揮發油對DPPH·具有清除作用，清除率隨著提取物濃度的增加而增大。揮發油對DPPH·自由基的半清除率（IC50）值為 3.3011 mg/mL，其清除DPPH·能力弱于維生素C（0.009 1 mg/mL）。

2.2.2清除羥基自由基（·OH）效果圖4和圖5分別為揮發油和維生素C對·OH的清除效果。可以看出，揮發油對·OH有一定的清除作用，且清除率隨著濃度的增加而增大，當濃度為4 mg/mL時，揮發油的清除率為72.48%。揮發油對·OH自由基的半清除率IC50值為3.075 5 mg/mL，其清除·OH能力弱于維生素C（0.347 7 mg/mL）。

2.2.3清除超氧自由基（ O-2· ）效果圖6和圖7分別為揮發油和維素C對 O-2· 的清除效果，可見揮發油在3 mg/mL的清除率達到64.39%。揮發油的IC50值為2.342 4 mg/mL，其清除率低于維素C（0.229 9 mg/mL）。

3討論與結論

采用硫酸催化甲酯化衍生化方法，對野葛藤揮發油進行了GC-MS分析，鑒定出64種化合物，其中醇類化合物（7個）占總量的5.22%；酮類化合物（2個）占4.41%；烯烴類化合物（3個）占0.65%；烷烴類化合物（3個）占0.12%；

醛類化合物（6個）占0.32%；酸類化合物（31個）占6972%；芳烴類化合物（4個）占0.65%；酯類化合物（4個）占3.55%；其他化合物（1個）占1.35%。

本研究通過清除DPPH·自由基能力、清除羥自由基能力、清除超氧陰離子能力3個方面試驗，并與維生素C進行比較，得出較為客觀的結論：野葛藤揮發油對3種自由基（DPPH·、·OH、 O-2· ）均有較好的清除作用，可開發為天然抗氧化劑。

參考文獻：

[1]趙亮，潘顯道，朱承根. 葛根黃酮的研究進展[J]. 醫學研究通訊，2004，33（11）：33-35.

[2]周艷暉，岑穎洲，李藥蘭，等. 廣東連南地區野葛花揮發油成分的GC-MS分析[J]. 暨南大學學報：自然科學與醫學版，2004，25（3）：381-385.

[3]Liyana-Pathirana C M，Shahidi F. Antioxidant and free radical scavenging activities of whole wheat and milling fractions[J]. Food Chemistry，2007，101（3）： 1151-1157.

[4]許申鴻，杭瑚. 葡萄籽和葡萄片清除自由基作用的研究[J]. 食品科學，1999（12）：28-30.

[5]于立梅，趙謀明，崔春，等. 山竹殼中原花青素提取分級及抗氧化活性的研究[J]. 食品與機械，2007，23（4）：60-64.

[6]Ouettier-Deleu C，Gressier B，Vasseur J，et al. Phenolic compounds and antioxidant activities of buckwheat（Fagopyrum esculentum Moench） hulls and flour[J]. Journal of Ethnopharmacology，2000，72（1/2）： 35-42.endprint