環介導等溫擴增技術快速檢測金黃色葡萄球菌

張濤濤+王蘭+龔頻+陳福欣

摘要：研究了用環介導等溫擴增技術（LAMP）快速檢測金黃色葡萄球菌的方法。首先根據金黃色葡萄球菌的耐熱核酸酶基因nuc中的保守序列設計特異性引物，建立并優化反應條件，然后通過對金黃色葡萄球菌及其他菌種的對比試驗，驗證引物的特異性并確定方法的檢測限。結果表明：在用加環引物的條件下，LAMP反應體系于60 ℃反應 35 min 即可擴增成功，而用未加環的引物則需45 min才能看到白色絮狀沉淀。對2株金黃色葡萄球菌、3株大腸桿菌、1株醋酸桿菌、1株沙門氏菌進行同步檢測，結果發現2株金黃色葡萄球菌均顯示陽性，而其他菌株均顯示陰性。研究確定了LAMP檢測純培養的金黃色葡萄球菌的最低檢測限為100 fg，比PCR的最低檢測限低2個數量級。由研究結果可以看出，LAMP法檢測金黃色葡萄球菌操作簡便，有較高的特異性、靈敏度，為快速檢測食品中的致病菌提供了較好的技術平臺。

關鍵詞：環介導等溫擴增技術；金黃色葡萄球菌；耐熱核酸酶基因nuc；快速檢測

中圖分類號：TS207.4文獻標志碼：A文章編號：1002-1302（2014）02-0238-03

收稿日期：2013-06-27

項目基金：陜西省自然科學基金（編號：2012JQ2011）；陜西省教育廳自然科學基金（編號：12JK0712、12JK0623）；西安市未央區項目（編號：201112、201209）。

作者簡介：張濤濤（1984—），女，山西孝義人，碩士研究生，主要從事食品安全快速檢測技術的研究。E-mail：ztt2008523220302@126.com。

通信作者：王蘭，女，教授，主要從事藥物與功能性食品研究工作。E-mail：wanglan1963@126.com。金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是食品中的三大致病菌之一[1]，在自然界中廣泛存在。隨著抗生素的廣泛使用，出現了大量的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌，這些金黃色葡萄球菌均可以產生導致人們食物中毒的SEs、TSST等毒力因子[2]。據美國疾病控制中心顯示，美國在近年來由于金黃色葡萄球菌而導致的食品中毒事件占33%，居世界第二位[3]，而我國由金黃色葡萄球菌引起的食品中毒事件更是屢見不鮮。

目前我國對于金黃色葡萄球菌包括耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的檢測方法以微生物培養法為主，但其檢測時間長、靈敏度相對不高；而傳統的核酸擴增技術，如PCR、實時PCR及鏈置換擴增法等，雖然檢測時間相對較短，但在實際操作中仍然存在儀器昂貴、誤差大等諸多缺陷[4]，從而限制了這些傳統的檢測技術在基層的廣泛推廣。因此，目前亟需建立一種高效、快速且特異性強、靈敏度高的檢測方法。

環介導等溫擴增方法（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是一種由日本科學家Notomi開發的新型核酸擴增技術，其原理是在Bst酶作用下進行的一種自動式鏈置換合成DNA的反應[5]。LAMP法在65 ℃左右的恒溫條件下反應約50 min即可明顯觀察到白色絮狀沉淀，相比PCR技術，無需DNA變性，不需要長時間的熱循環及電泳檢測，是一種高效、特異性強、靈敏度高的分子檢測技術。張琳等將LAMP結合熒光技術應用于IBV病毒檢測[6]，李永剛等對金黃色葡萄球菌的產腸毒素基因fem進行了檢測[7]，唐夢君等以金黃色葡萄球菌的耐熱核酸酶nuc基因作為靶基因設計了2對引物，即外引物、內引物[8]。本研究以金黃色葡萄球菌的nuc基因為靶基因設計了3對特異性引物，即外引物、內引物、環引物，在此基礎上進行LAMP反應條件的優化，并進行引物的特異性鑒定及檢測限的確定。

1材料與方法

1.1主要儀器與試劑

主要儀器有PCR擴增儀（MJ Research），凝膠成像系統，冷凍高速離心機，DDC-10C型電泳儀（北京君意東方電泳設備有限公司），水浴鍋等。

主要生化試劑有Bst聚合酶，Taq聚合酶，dNTPs，DNA marker等，均購自寶生物工程（大連）有限公司；無水乙醇購自天津天力化學試劑有限公司；培養基牛肉膏、酵母膏、蛋白胨等均購自北京奧博星生物技術有限公司。

1.2試驗菌種

金黃色葡萄球菌（ATCC14458）、釀膿鏈球菌（ATCC19615）、沙門氏菌（ATCC14028）由中國普通微生物菌種保藏中心提供；金黃色葡萄球菌（ATCC25923）、大腸桿菌（ATCC35218）由中國藥品生物制品檢定所提供；大腸桿菌（CMCC44752）由中國醫學細菌保藏管理中心提供；大腸桿菌（O157：H7）為實驗室保藏。

1.3引物的設計與合成

根據GenBank中公布的金黃色葡萄球菌nuc基因的保守序列，采用引物設計軟件Primer Explore 3.0進行引物設計，篩選得到一套引物，包括外引物、內引物、環引物，詳見表1。設計完成后委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.4DNA的提取

1.5LAMP擴增及條件的優化

1.6LAMP特異性試驗

本試驗選取金黃色葡萄球菌（ATCC14458）、金黃色葡萄球菌（ATCC25923）、大腸桿菌（ATCC35218）、大腸桿菌（CMCC44752）、大腸桿菌（O157：H7）、釀膿鏈球菌（ATCC19615）、沙門氏菌（ATCC14028）作為LAMP研究對象，用以評價金黃色葡萄球菌nuc基因引物的特異性。

1.7LAMP靈敏度試驗

將本試驗提取的金黃色葡萄球菌（ATCC14458）DNA用生理鹽水稀釋10倍及以上，并用蒸餾水作為陰性對照，觀察LAMP檢測金黃色葡萄球菌的最低檢測限。

2結果與分析endprint

2.1LAMP檢測結果

本研究以金黃色葡萄球菌的nuc基因來設計特異性引物并進行LAMP 擴增檢測，其擴增結果見圖1，可以看出金黃色葡萄球菌的nuc基因用LAMP擴增后出現典型的梯狀條帶，而以蒸餾水代替DNA的陰性對照未出現梯狀條帶。另外發現，在擴增完成并且離心后，EP管底部出現白色沉淀，而陰性對照組未出現白色沉淀。

2.2LAMP檢測條件優化結果

2.2.1LAMP反應溫度應用建立的LAMP方法，在其他條件不變的情況下對反應溫度進一步優化。如圖2所示，泳道

5、7出現明顯的梯狀條帶，而其余溫度的沒有擴增成功，說明該反應的最適反應溫度為60 ℃。

2.2.2LAMP反應時間從圖3可以看出：在其他條件不變的情況下，不同反應時間對擴增有影響，當反應時間為35 min時即開始擴增，且在45 min時出現了明顯的梯狀條帶。

2.2.3LAMP引物圖4表明：加入環引物與否并不影響LAMP 的成功擴增，但是加入環引物的LAMP擴增速率明顯比未加環引物的擴增速率高（表1），加環引物的擴增只需 35 min，而未加環引物的需要45 min才可見到絮狀沉淀，說明加環引物能加快LAMP的反應速率。

2.3LAMP檢測特異性試驗結果

應用上述試驗建立并優化的LAMP反應條件，針對2株金黃色葡萄球菌、3株大腸桿菌、1株醋酸桿菌及1株沙門氏菌進行檢測，結果顯示：只有金黃色葡萄球菌顯示陽性，而其余菌均顯示陰性。說明本試驗中根據金黃色葡萄球菌的nuc基因設計的引物具有較高的特異性。

2.4LAMP檢測限試驗結果

針對提取的DNA模板進行梯度稀釋，即分別稀釋為10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7的濃度。結果表明：陰性對照沒有梯狀條帶出現，且LAMP檢測的最低限度為 100 fg，較PCR有較高的檢測限。

3結論

引物設計是LAMP法的關鍵，若引物質量不好，容易使引物間形成小于100 bp的聚合物[9]。本研究以金黃色葡萄球菌的nuc基因作為靶基因，并據該基因的6個位點設計引物，增加了擴增的特異性。針對所檢測的菌種，僅有金黃色葡萄球菌顯示陽性，而其余菌種均顯示陰性，說明本研究設計的引物有較好的特異性。

BstDNA聚合酶大片段是分離于嗜熱脂肪芽孢桿菌的DNA聚合酶的一部分，具有5′-3′核酸外切酶的活性[10]，不僅需要在高濃度的Mg2+環境下反應，而且溫度不宜超過 70 ℃，以免使其失去活性。在本試驗中，60 ℃時擴增效果最好，可能由于溫度低于60 ℃時，酶的活性沒有被激活，而溫度到70 ℃時，酶的活性已經失去，因此未能擴增成功。

對于反應中加入環引物與未加環引物的研究，由本試驗可知：加入環引物僅需30min即可看到白色絮狀沉淀，而未加入環引物要45 min才可以看到沉淀。這與梁磊研究的加環引物的比未加環引物的提前1/3看到白色沉淀是一致的[11]，而且同Nagamine 等研究的加入環引物可以使反應時間縮短30%～50%的結果[12]一致。

LAMP是一種經濟、快速、準確、靈敏的分子檢測技術，已經被廣泛應用于諸多領域，但是在國內較少應用于食品質量檢測方面，可能由于篩選合適的引物比較困難。隨著研究的不斷深入，相信LAMP技術會很快普及到食品安全檢測領域。

參考文獻：

[1]高濤. 食品中金黃色葡萄球菌腸毒素及檢測方法的研究進展[J]. 福建分析測試，2003，12（2）：39-42.

[2]Udo E E，Al-Mufti S，Albert M J. The prevalence of antimicrobial resistance and carriage of virulence genes in Staphylococcus aureus isolated from food handlers in Kuwait City restaurants[J]. BMC Research Notes，2009（2）：108.

[3]Yang H，Ma X Y，Zhang X Z，et al. Development and evaluation of a loop-mediated isothermal amplification assay for the rapid detection of Staphylococcus aureus in food[J]. European Food Research and Technology，2011，232（5）：769-776.

[4]曾冰冰，肖凱軍，石磊，等. LAMP方法在食品微生物檢測中的應用[J]. 現代食品與藥品雜志，2007，17（1）：22-25.

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[6]張琳，馬利，丁雅苓，等. 基于熒光顯色的IBV LAMP檢測方法研究[J]. 西北農林科技大學學報：自然科學版，2012，40（10）：38-44.

[7]李永剛，王德國，武建剛，等. 環介導恒溫擴增法（LAMP）檢測金黃色葡萄球菌[J]. 食品工業科技，2010（1）：388-391.

[8]唐夢君，周生，葛慶聯，等. 應用LAMP快速檢測金黃色葡萄球菌的研究[J]. 現代食品科技，2011，27（6）：719-722.

[9]歐新華，張如勝，宋克云，等. 逆轉錄-環介導等溫擴增方法檢測甲型H1N1流感病毒[J]. 中華檢驗醫學雜志，2010，33（5）：443-445.

[10]Rittié L，Perbal B. Enzymes used in molecular biology：a useful guide[J]. Journal of Cell Communications and Signaling，2008，2（1/2）：25-45.

[11]梁磊. 應用環介導等溫擴增技術檢測牛肉中大腸桿菌O157的研究[D]. 保定：河北農業大學，2011.

[12]Nagamine K，Hase T，Notomi T. Accelerated reaction by loop-mediated isothermal amplification using loop primers[J]. Molecular and Cellular Probes，2002，16（3）：223-229.endprint

2.1LAMP檢測結果

本研究以金黃色葡萄球菌的nuc基因來設計特異性引物并進行LAMP 擴增檢測，其擴增結果見圖1，可以看出金黃色葡萄球菌的nuc基因用LAMP擴增后出現典型的梯狀條帶，而以蒸餾水代替DNA的陰性對照未出現梯狀條帶。另外發現，在擴增完成并且離心后，EP管底部出現白色沉淀，而陰性對照組未出現白色沉淀。

2.2LAMP檢測條件優化結果

2.2.1LAMP反應溫度應用建立的LAMP方法，在其他條件不變的情況下對反應溫度進一步優化。如圖2所示，泳道

5、7出現明顯的梯狀條帶，而其余溫度的沒有擴增成功，說明該反應的最適反應溫度為60 ℃。

2.2.2LAMP反應時間從圖3可以看出：在其他條件不變的情況下，不同反應時間對擴增有影響，當反應時間為35 min時即開始擴增，且在45 min時出現了明顯的梯狀條帶。

2.2.3LAMP引物圖4表明：加入環引物與否并不影響LAMP 的成功擴增，但是加入環引物的LAMP擴增速率明顯比未加環引物的擴增速率高（表1），加環引物的擴增只需 35 min，而未加環引物的需要45 min才可見到絮狀沉淀，說明加環引物能加快LAMP的反應速率。

2.3LAMP檢測特異性試驗結果

應用上述試驗建立并優化的LAMP反應條件，針對2株金黃色葡萄球菌、3株大腸桿菌、1株醋酸桿菌及1株沙門氏菌進行檢測，結果顯示：只有金黃色葡萄球菌顯示陽性，而其余菌均顯示陰性。說明本試驗中根據金黃色葡萄球菌的nuc基因設計的引物具有較高的特異性。

2.4LAMP檢測限試驗結果

針對提取的DNA模板進行梯度稀釋，即分別稀釋為10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7的濃度。結果表明：陰性對照沒有梯狀條帶出現，且LAMP檢測的最低限度為 100 fg，較PCR有較高的檢測限。

3結論

引物設計是LAMP法的關鍵，若引物質量不好，容易使引物間形成小于100 bp的聚合物[9]。本研究以金黃色葡萄球菌的nuc基因作為靶基因，并據該基因的6個位點設計引物，增加了擴增的特異性。針對所檢測的菌種，僅有金黃色葡萄球菌顯示陽性，而其余菌種均顯示陰性，說明本研究設計的引物有較好的特異性。

BstDNA聚合酶大片段是分離于嗜熱脂肪芽孢桿菌的DNA聚合酶的一部分，具有5′-3′核酸外切酶的活性[10]，不僅需要在高濃度的Mg2+環境下反應，而且溫度不宜超過 70 ℃，以免使其失去活性。在本試驗中，60 ℃時擴增效果最好，可能由于溫度低于60 ℃時，酶的活性沒有被激活，而溫度到70 ℃時，酶的活性已經失去，因此未能擴增成功。

對于反應中加入環引物與未加環引物的研究，由本試驗可知：加入環引物僅需30min即可看到白色絮狀沉淀，而未加入環引物要45 min才可以看到沉淀。這與梁磊研究的加環引物的比未加環引物的提前1/3看到白色沉淀是一致的[11]，而且同Nagamine 等研究的加入環引物可以使反應時間縮短30%～50%的結果[12]一致。

LAMP是一種經濟、快速、準確、靈敏的分子檢測技術，已經被廣泛應用于諸多領域，但是在國內較少應用于食品質量檢測方面，可能由于篩選合適的引物比較困難。隨著研究的不斷深入，相信LAMP技術會很快普及到食品安全檢測領域。

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[10]Rittié L，Perbal B. Enzymes used in molecular biology：a useful guide[J]. Journal of Cell Communications and Signaling，2008，2（1/2）：25-45.

[11]梁磊. 應用環介導等溫擴增技術檢測牛肉中大腸桿菌O157的研究[D]. 保定：河北農業大學，2011.

[12]Nagamine K，Hase T，Notomi T. Accelerated reaction by loop-mediated isothermal amplification using loop primers[J]. Molecular and Cellular Probes，2002，16（3）：223-229.endprint

2.1LAMP檢測結果

本研究以金黃色葡萄球菌的nuc基因來設計特異性引物并進行LAMP 擴增檢測，其擴增結果見圖1，可以看出金黃色葡萄球菌的nuc基因用LAMP擴增后出現典型的梯狀條帶，而以蒸餾水代替DNA的陰性對照未出現梯狀條帶。另外發現，在擴增完成并且離心后，EP管底部出現白色沉淀，而陰性對照組未出現白色沉淀。

2.2LAMP檢測條件優化結果

2.2.1LAMP反應溫度應用建立的LAMP方法，在其他條件不變的情況下對反應溫度進一步優化。如圖2所示，泳道

5、7出現明顯的梯狀條帶，而其余溫度的沒有擴增成功，說明該反應的最適反應溫度為60 ℃。

2.2.2LAMP反應時間從圖3可以看出：在其他條件不變的情況下，不同反應時間對擴增有影響，當反應時間為35 min時即開始擴增，且在45 min時出現了明顯的梯狀條帶。

2.2.3LAMP引物圖4表明：加入環引物與否并不影響LAMP 的成功擴增，但是加入環引物的LAMP擴增速率明顯比未加環引物的擴增速率高（表1），加環引物的擴增只需 35 min，而未加環引物的需要45 min才可見到絮狀沉淀，說明加環引物能加快LAMP的反應速率。

2.3LAMP檢測特異性試驗結果

應用上述試驗建立并優化的LAMP反應條件，針對2株金黃色葡萄球菌、3株大腸桿菌、1株醋酸桿菌及1株沙門氏菌進行檢測，結果顯示：只有金黃色葡萄球菌顯示陽性，而其余菌均顯示陰性。說明本試驗中根據金黃色葡萄球菌的nuc基因設計的引物具有較高的特異性。

2.4LAMP檢測限試驗結果

針對提取的DNA模板進行梯度稀釋，即分別稀釋為10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7的濃度。結果表明：陰性對照沒有梯狀條帶出現，且LAMP檢測的最低限度為 100 fg，較PCR有較高的檢測限。

3結論

引物設計是LAMP法的關鍵，若引物質量不好，容易使引物間形成小于100 bp的聚合物[9]。本研究以金黃色葡萄球菌的nuc基因作為靶基因，并據該基因的6個位點設計引物，增加了擴增的特異性。針對所檢測的菌種，僅有金黃色葡萄球菌顯示陽性，而其余菌種均顯示陰性，說明本研究設計的引物有較好的特異性。

BstDNA聚合酶大片段是分離于嗜熱脂肪芽孢桿菌的DNA聚合酶的一部分，具有5′-3′核酸外切酶的活性[10]，不僅需要在高濃度的Mg2+環境下反應，而且溫度不宜超過 70 ℃，以免使其失去活性。在本試驗中，60 ℃時擴增效果最好，可能由于溫度低于60 ℃時，酶的活性沒有被激活，而溫度到70 ℃時，酶的活性已經失去，因此未能擴增成功。

對于反應中加入環引物與未加環引物的研究，由本試驗可知：加入環引物僅需30min即可看到白色絮狀沉淀，而未加入環引物要45 min才可以看到沉淀。這與梁磊研究的加環引物的比未加環引物的提前1/3看到白色沉淀是一致的[11]，而且同Nagamine 等研究的加入環引物可以使反應時間縮短30%～50%的結果[12]一致。

LAMP是一種經濟、快速、準確、靈敏的分子檢測技術，已經被廣泛應用于諸多領域，但是在國內較少應用于食品質量檢測方面，可能由于篩選合適的引物比較困難。隨著研究的不斷深入，相信LAMP技術會很快普及到食品安全檢測領域。

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[11]梁磊. 應用環介導等溫擴增技術檢測牛肉中大腸桿菌O157的研究[D]. 保定：河北農業大學，2011.

[12]Nagamine K，Hase T，Notomi T. Accelerated reaction by loop-mediated isothermal amplification using loop primers[J]. Molecular and Cellular Probes，2002，16（3）：223-229.endprint