熒光染色法研究茄子花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂及其雄配子體發(fā)育

唐紅艷+崔群香+韓長(zhǎng)奎+閆素芹+王倩+劉衛(wèi)東

摘要：應(yīng)用H33258熒光染色法研究茄子花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂、雄配子體發(fā)育過(guò)程。結(jié)果表明：茄子花粉母細(xì)胞中胞質(zhì)分裂方式為同時(shí)型；成熟花粉粒為2-細(xì)胞型，包括1個(gè)營(yíng)養(yǎng)核、1個(gè)精細(xì)胞；減數(shù)分裂中期Ⅰ可觀察到12個(gè)二價(jià)體，小孢子有絲分裂中期可觀察到12條染色體，是染色體計(jì)數(shù)的最佳時(shí)期；四分體排列方式有平面型、四面體型，四分體細(xì)胞體積可作為單核中晚期小孢子的間接比較標(biāo)準(zhǔn)。

關(guān)鍵詞：茄子；花粉母細(xì)胞；減數(shù)分裂；雄配子體發(fā)育

中圖分類號(hào)： S641.101文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2014）02-0107-03

收稿日期：2013-06-06

基金項(xiàng)目：江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金[編號(hào)：CX（11）1005]。

作者簡(jiǎn)介：唐紅艷（1990—），女，江蘇泗陽(yáng)人，主要從事蔬菜種子繁育工作。

通信作者：崔群香，博士，副教授，從事園藝作物遺傳育種教學(xué)和科研工作。E-mail：cqx@jit.edu. cn。茄子（Solanum melongena L.）是茄科茄屬的重要蔬菜，染色體數(shù)2n=24。茄子主要病害有黃萎病、褐紋病、青枯病、早疫病、病毒病、綿疫病等，以黃萎病危害最重。茄子近緣野生種含有多種優(yōu)良抗病基因，通過(guò)遠(yuǎn)緣雜交創(chuàng)制新型異染色體系材料，開(kāi)展染色體工程育種已成為茄子抗病育種的突破口[1]。因此，開(kāi)展細(xì)胞、分子遺傳學(xué)研究對(duì)于茄子染色體工程育種具有重要意義。了解花粉母細(xì)胞中染色體的構(gòu)型、比例及其動(dòng)態(tài)變化，準(zhǔn)確識(shí)別花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂特征，是研究栽培茄與其野生種染色體互作的前提，也有利于提高各種異染色體系材料的創(chuàng)制效率[2]。觀察雄配子體的發(fā)育過(guò)程，有利于確定花蕾形態(tài)與雄配子體發(fā)育階段之間的關(guān)系，提高花藥、小孢子培養(yǎng)時(shí)供體材料花蕾選取的準(zhǔn)確性。目前關(guān)于茄子的細(xì)胞學(xué)研究主要集中在染色體核型分析[3-4]以及減數(shù)分裂上[5]，雄配子體發(fā)育研究很少?；ǚ勰讣?xì)胞減數(shù)分裂研究中常用的方法包括改良苯酚品紅法（卡寶品紅）、蘇木精染色法、壓片觀察技術(shù)，雄配子體發(fā)育需要結(jié)合使用染色、冬青油透明技術(shù)[6]。熒光染色結(jié)合透明技術(shù)用于觀察染色體較小的不結(jié)球白菜二倍體、四倍體[7-8]，已應(yīng)用于南瓜、向日葵等作物上[9-10]，但未見(jiàn)其應(yīng)用于茄子減數(shù)分裂、雄配子體發(fā)育研究。本研究利用熒光染色法研究茄子減數(shù)分裂、雄配子體發(fā)育，以便快速確定植株染色體數(shù)目、配子體發(fā)育階段，旨在為茄子分子生物學(xué)研究提供快捷有效的方法。

1材料與方法

1.1材料

供試茄子品種為滬茄四號(hào)，2011年11月上旬溫室育苗，2012年3月中旬定植于連棟棚內(nèi)，4月中旬晴天10：00左右取不同大小的花蕾，用自封袋放入冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室，4 ℃冰箱中放置24 h，然后將花蕾分成4個(gè)級(jí)別：（1）花萼未開(kāi)及花萼剛張開(kāi)，花瓣距花萼筒>2 mm；（2）花萼張開(kāi)，花瓣距花萼筒≤2 mm；（3）花萼張開(kāi)，花瓣超過(guò)花萼筒0～2 mm；（4）花瓣超過(guò)花萼筒2 mm以上。

1.2方法

將上述4個(gè)級(jí)別的花蕾剝?nèi)ポ嗥舫龌ㄋ帲謩e用卡諾固定液進(jìn)行固定，經(jīng)95%、85%、70%、50%、30%梯度乙醇和蒸餾水各浸泡沖洗20 min，然后轉(zhuǎn)入pH值為5.0的磷酸二氫鈉-檸檬酸緩沖液中放置24 h以上。25 ℃黑暗條件下，用20 μg/L H33258染色數(shù)小時(shí)并過(guò)夜。搗碎花藥并吸取含花粉母細(xì)胞或雄配子體的碎片，滴在載玻片上，蓋上蓋玻片，輕輕按壓，用Nikon80i熒光顯微鏡在紫外激發(fā)的熒光下觀察、統(tǒng)計(jì)并拍照。

2結(jié)果與分析

2.1花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂

在萼片未張開(kāi)的花蕾中，很多花粉母細(xì)胞處于減數(shù)分裂時(shí)期。進(jìn)入減數(shù)分裂的花粉母細(xì)胞體積增大，原生質(zhì)體濃厚，容易與周圍的其他細(xì)胞區(qū)分開(kāi)來(lái)。前期Ⅰ持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)，染色體形態(tài)變化較大。偶線期同源染色體開(kāi)始聯(lián)會(huì)，染色體呈花束狀（圖1-1）；粗線期聯(lián)會(huì)已經(jīng)完成，且染色體繼續(xù)縮短變粗；雙線期染色體進(jìn)一步螺旋化并加粗，聯(lián)會(huì)復(fù)合體已經(jīng)解體，但各非姊妹染色體仍由交叉結(jié)連結(jié)在一起，表現(xiàn)為“X”等構(gòu)型（圖1-2）；終變期染色體進(jìn)一步螺旋，達(dá)到最粗，并開(kāi)始向細(xì)胞中央集中，逐步進(jìn)入中期Ⅰ（圖1-3）；完全進(jìn)入中期Ⅰ的細(xì)胞中，二價(jià)體排列在赤道板附近，極面觀12個(gè)二價(jià)體清晰可計(jì)數(shù)（圖1-4），垂面觀可見(jiàn)棒狀、“E”形二價(jià)體，且二價(jià)體中的2條染色體有分開(kāi)的趨勢(shì)（圖1-5）；由于紡錘絲的牽引，同源染色體分離，并且向兩極移動(dòng)，進(jìn)入后期Ⅰ（圖1-6）；染色體移至兩極，核膜重新出現(xiàn)，此后直到染色體松散，進(jìn)入前期Ⅱ，細(xì)胞質(zhì)一直未見(jiàn)分裂（圖1-7）；隨著核膜消失，染色體凝縮至清晰可辨，進(jìn)入減數(shù)分裂中期Ⅱ，垂面觀可見(jiàn)二價(jià)紡錘面呈現(xiàn)一定角度（圖1-8）；染色單體分離，核

膜形成，細(xì)胞壁尚未形成，進(jìn)入末期Ⅱ，多數(shù)細(xì)胞中只見(jiàn)到3個(gè)細(xì)胞核（圖1-9）；隨后產(chǎn)生胼胝質(zhì)壁，把4個(gè)細(xì)胞隔開(kāi)，形成四分體，四分體也多為四面體型（圖1-10），極少數(shù)為平面型（圖1-11）。

2.2雄配子體發(fā)育

花萼已張開(kāi)的花蕾中，多數(shù)花粉母細(xì)胞已完成減數(shù)分裂，處于四分體及隨后時(shí)期。四分體胼胝質(zhì)壁解體，釋放出小孢子，進(jìn)入雄配子體發(fā)育過(guò)程。同大多數(shù)作物類似，剛釋放出來(lái)處于單核早期的小孢子形狀不規(guī)則，細(xì)胞質(zhì)中沒(méi)有液泡，小孢子體積小；隨后細(xì)胞核位于細(xì)胞中央，細(xì)胞不同部位開(kāi)始出現(xiàn)小液泡，為單核居中期（圖1-12）；受液泡的擠壓，細(xì)胞核向細(xì)胞壁靠近，核膜清晰，為單核靠邊期（圖1-13）；隨后核膜消失，出現(xiàn)清晰可辨的12條染色體，進(jìn)入單核有絲分裂中期（圖1-14）；有絲分裂完成后，小孢子進(jìn)入二核期，剛分裂產(chǎn)生的2個(gè)細(xì)胞核，除1個(gè)細(xì)胞核熒光較亮外，形狀、大小差異不大（圖1-15）；隨后較亮的細(xì)胞形狀由圓變扁、由短變長(zhǎng)，小孢子體積也不斷增大，但細(xì)胞不再分裂（圖1-16至圖1-18）。成熟花粉粒多為橢球形，但不同花粉粒之間有一定差異（圖1-19）。endprint

2.3雄配子體發(fā)育時(shí)期及與花蕾形態(tài)特征之間的關(guān)系

由于單核中期細(xì)胞大小與四分體類似，而四分體之前的花粉母細(xì)胞體積小于四分體，且從結(jié)構(gòu)上易與小孢子區(qū)分開(kāi)來(lái)，因此可以根據(jù)細(xì)胞體積判斷雄配子體發(fā)育階段：小于四分體則為單核早期，等于或接近四分體則為單核中晚期，明顯大于四分體則為二核期。據(jù)此對(duì)（2）至（4）級(jí)花蕾中細(xì)胞發(fā)育階段進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)（2）級(jí)花蕾中約有4%細(xì)胞為四分體，其余多數(shù)為單核小孢子；（3）級(jí)花蕾中均為單核小孢子，且僅3%處于單核早期，其余為單核中晚期；（4）級(jí)花蕾中80%以上的細(xì)胞處于雙核期。

3結(jié)論與討論

本研究首次用熒光染色觀察法探討了茄子花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂及其雄配子體發(fā)育各個(gè)時(shí)期的主要特征，以及單核期小孢子所對(duì)應(yīng)的花蕾形態(tài)特征。采用了24 h低溫預(yù)處理、熒光染色方法，染色體在各個(gè)時(shí)期特征非常明顯，染色體發(fā)出明亮的熒光，避免了細(xì)胞質(zhì)中其他物質(zhì)的干擾，對(duì)于茄子、白菜等花粉壁熒光不強(qiáng)烈的材料，即使觀察雄配子體發(fā)育也不需要進(jìn)行冬青油透明。適合茄屬植物游離小孢子培養(yǎng)的花粉發(fā)育時(shí)期一般為單核期或單核中晚期[11-14]。小孢子發(fā)育時(shí)期與花蕾形態(tài)特征密切相關(guān)，多數(shù)研究者用花蕾直徑、花蕾長(zhǎng)、花藥顏色[15]，花蕾瓣長(zhǎng)與萼裂比[16]，花瓣長(zhǎng)與萼裂基部之差等作為適宜培養(yǎng)的小孢子發(fā)育時(shí)期相關(guān)形態(tài)特征，并以此作為取樣依據(jù)[17]。本研究表明，花瓣長(zhǎng)度與花萼筒長(zhǎng)度之間的差值可以作為茄子小孢子培養(yǎng)的取材依據(jù)，這與馬欣的結(jié)論[17]類似。

參考文獻(xiàn)：

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[14]朱朝輝，鐘開(kāi)勤，黃建都，等. 茄子游離小孢子培養(yǎng)初探[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)，2011，32（10）：1883-1887.

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[17]馬欣. 茄子游離小孢子培養(yǎng)及其形態(tài)發(fā)育學(xué)觀察[D]. 保定：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2006.endprint

2.3雄配子體發(fā)育時(shí)期及與花蕾形態(tài)特征之間的關(guān)系

由于單核中期細(xì)胞大小與四分體類似，而四分體之前的花粉母細(xì)胞體積小于四分體，且從結(jié)構(gòu)上易與小孢子區(qū)分開(kāi)來(lái)，因此可以根據(jù)細(xì)胞體積判斷雄配子體發(fā)育階段：小于四分體則為單核早期，等于或接近四分體則為單核中晚期，明顯大于四分體則為二核期。據(jù)此對(duì)（2）至（4）級(jí)花蕾中細(xì)胞發(fā)育階段進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)（2）級(jí)花蕾中約有4%細(xì)胞為四分體，其余多數(shù)為單核小孢子；（3）級(jí)花蕾中均為單核小孢子，且僅3%處于單核早期，其余為單核中晚期；（4）級(jí)花蕾中80%以上的細(xì)胞處于雙核期。

3結(jié)論與討論

本研究首次用熒光染色觀察法探討了茄子花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂及其雄配子體發(fā)育各個(gè)時(shí)期的主要特征，以及單核期小孢子所對(duì)應(yīng)的花蕾形態(tài)特征。采用了24 h低溫預(yù)處理、熒光染色方法，染色體在各個(gè)時(shí)期特征非常明顯，染色體發(fā)出明亮的熒光，避免了細(xì)胞質(zhì)中其他物質(zhì)的干擾，對(duì)于茄子、白菜等花粉壁熒光不強(qiáng)烈的材料，即使觀察雄配子體發(fā)育也不需要進(jìn)行冬青油透明。適合茄屬植物游離小孢子培養(yǎng)的花粉發(fā)育時(shí)期一般為單核期或單核中晚期[11-14]。小孢子發(fā)育時(shí)期與花蕾形態(tài)特征密切相關(guān)，多數(shù)研究者用花蕾直徑、花蕾長(zhǎng)、花藥顏色[15]，花蕾瓣長(zhǎng)與萼裂比[16]，花瓣長(zhǎng)與萼裂基部之差等作為適宜培養(yǎng)的小孢子發(fā)育時(shí)期相關(guān)形態(tài)特征，并以此作為取樣依據(jù)[17]。本研究表明，花瓣長(zhǎng)度與花萼筒長(zhǎng)度之間的差值可以作為茄子小孢子培養(yǎng)的取材依據(jù)，這與馬欣的結(jié)論[17]類似。

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[13]佟曦然，顧淑榮，朱至清，等. 茄子游離小孢子培養(yǎng)中小孢子發(fā)育的細(xì)胞學(xué)觀察[J]. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2007，15（5）：861-866.

[14]朱朝輝，鐘開(kāi)勤，黃建都，等. 茄子游離小孢子培養(yǎng)初探[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)，2011，32（10）：1883-1887.

[15]李亞榮. 茄子（Solanum melongena L.）花藥離體培養(yǎng)的研究[D]. 重慶：西南大學(xué)，2008.

[16]宋彥平，申書興，王彥華，等. 茄子游離小孢子培養(yǎng)獲得愈傷組織的研究[J]. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，30（3）：32-35.

[17]馬欣. 茄子游離小孢子培養(yǎng)及其形態(tài)發(fā)育學(xué)觀察[D]. 保定：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2006.endprint

2.3雄配子體發(fā)育時(shí)期及與花蕾形態(tài)特征之間的關(guān)系

由于單核中期細(xì)胞大小與四分體類似，而四分體之前的花粉母細(xì)胞體積小于四分體，且從結(jié)構(gòu)上易與小孢子區(qū)分開(kāi)來(lái)，因此可以根據(jù)細(xì)胞體積判斷雄配子體發(fā)育階段：小于四分體則為單核早期，等于或接近四分體則為單核中晚期，明顯大于四分體則為二核期。據(jù)此對(duì)（2）至（4）級(jí)花蕾中細(xì)胞發(fā)育階段進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)（2）級(jí)花蕾中約有4%細(xì)胞為四分體，其余多數(shù)為單核小孢子；（3）級(jí)花蕾中均為單核小孢子，且僅3%處于單核早期，其余為單核中晚期；（4）級(jí)花蕾中80%以上的細(xì)胞處于雙核期。

3結(jié)論與討論

本研究首次用熒光染色觀察法探討了茄子花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂及其雄配子體發(fā)育各個(gè)時(shí)期的主要特征，以及單核期小孢子所對(duì)應(yīng)的花蕾形態(tài)特征。采用了24 h低溫預(yù)處理、熒光染色方法，染色體在各個(gè)時(shí)期特征非常明顯，染色體發(fā)出明亮的熒光，避免了細(xì)胞質(zhì)中其他物質(zhì)的干擾，對(duì)于茄子、白菜等花粉壁熒光不強(qiáng)烈的材料，即使觀察雄配子體發(fā)育也不需要進(jìn)行冬青油透明。適合茄屬植物游離小孢子培養(yǎng)的花粉發(fā)育時(shí)期一般為單核期或單核中晚期[11-14]。小孢子發(fā)育時(shí)期與花蕾形態(tài)特征密切相關(guān)，多數(shù)研究者用花蕾直徑、花蕾長(zhǎng)、花藥顏色[15]，花蕾瓣長(zhǎng)與萼裂比[16]，花瓣長(zhǎng)與萼裂基部之差等作為適宜培養(yǎng)的小孢子發(fā)育時(shí)期相關(guān)形態(tài)特征，并以此作為取樣依據(jù)[17]。本研究表明，花瓣長(zhǎng)度與花萼筒長(zhǎng)度之間的差值可以作為茄子小孢子培養(yǎng)的取材依據(jù)，這與馬欣的結(jié)論[17]類似。

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