衡陽地區(qū)萵筍葉斑病病原菌的鑒定及其室內(nèi)藥劑篩選

李玉中+楊芳+劉春+滕濤+何麗芳

摘要：對衡陽地區(qū)的萵筍葉斑病病原菌進行了分離和形態(tài)學(xué)鑒定，并采用平皿菌絲生長抑制法測定供試藥劑對病菌菌絲生長的抑制活性，比較了4種殺菌劑對致病菌的抑制效果，結(jié)果表明：衡陽地區(qū)萵筍葉斑病致病菌為微疣匍柄霉[Stemphylium chisha （Nish） Yannamoto]，在供試藥劑中甲霜·錳鋅、代森錳鋅的抑菌效果較好，EC50分別為6.58、634 mg/L；其次是多菌靈，其EC50為458 mg/L；最后是百菌清，其EC50 為2 107 mg/L。

關(guān)鍵詞：萵筍葉斑病；藥劑篩選；生長抑制；菌落直徑

中圖分類號： S436.36文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2014）02-0102-03

收稿日期：2013-06-07

基金項目：湖南省衡陽市科技發(fā)展計劃（編號：2011KN12）。

作者簡介：李玉中（1978—），男，山東聊城人，博士，副教授，主要從事微生物及植物病害防治等方面的研究。E-mail：yzl_2002@163.com。萵筍（Lactuca sativa）為菊科（Compositaeaceae）1年生或2年生草本植物，在我國各地普遍栽培。萵筍肉質(zhì)細嫩，常吃萵筍可增強胃液和消化液分泌，增進膽汁分泌。萵筍含豐富的鉀、氟元素及胡蘿卜素，可為人提供豐富的營養(yǎng)。此外，萵筍葉還具有一定的平咳作用[1]。萵筍在我國的種植面積越來越大，同時其病害的發(fā)生及其造成的經(jīng)濟損失也在增大，尤其是萵筍葉斑病[2]。本研究對湖南省衡陽地區(qū)萵筍葉斑病的病原菌進行了分離、純化、鑒定和藥劑篩選，以期找出防治萵筍病害的最佳藥劑，為衡陽地區(qū)萵筍葉斑病的防治提供科學(xué)參考。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1試驗菌株分離自衡陽地區(qū)尖葉青筍發(fā)病的典型葉片上的病原菌。

1.1.2培養(yǎng)基和試劑PDA：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 L；0.1%的HgCl2消毒液；參照方中達方法[3]配制。

試驗藥劑：（1）純品多菌靈可濕性粉劑（山東富先達農(nóng)藥有限公司）；（2）70%甲基硫菌靈可濕性粉劑（珠海凱特生物技術(shù)有限公司）；（3）75%百菌清可濕性粉劑（吉林力生農(nóng)化農(nóng)藥有限公司）；（4）進口80%代森錳鋅可濕性粉劑（奧瑞特農(nóng)藥有限責(zé)任公司）；（5）72%甲霜·錳鋅可濕性粉劑（重慶易豐科技發(fā)展有限公司）。

1.2試驗方法

1.2.1樣品采集于衡陽市各地采集尖葉青筍上明顯發(fā)病病葉，將葉片裝入封口塑料袋中帶回實驗室待用。

1.2.2菌株的分離、純化與保存從采集的樣品中，選出具有典型病斑的葉片，以常規(guī)組織分離法[3]進行分離。在每個葉片上分離3～5塊組織，每一病斑于病健交界處切取約 5 mm2 的病組織，然后用70%乙醇浸20～30 s，再在0.1%的酸性氯化汞水溶液中浸1～2 min，再用滅菌水換洗4次，置于PDA平板上，每皿接種4～5個葉斑。接種完畢后將其置于（25±1） ℃條件下培養(yǎng)。待病組織長出菌絲后，觀察菌絲生長情況，選取菌絲一致的菌落，用接種針挑取菌株的周邊菌絲于新的PDA平板上于（25±1） ℃下培養(yǎng)4 d，將分離到的純種菌株接種試管斜面，于（25±1） ℃下培養(yǎng)至菌絲長滿斜面，置 4 ℃ 冰箱保存待用。

1.2.3病原菌的鑒定將純化的菌株在PDA上培養(yǎng)7～10 d，挑取菌落組織，顯微鏡下觀察菌絲、分生孢子的形態(tài)并拍照。根據(jù)形態(tài)參考《中國真菌志》第三十一卷暗色磚格分生孢子真菌的描述[4]對病菌進行鑒定。

1.2.4藥劑篩選采用含藥平板法[5-7]。根據(jù)預(yù)試驗的結(jié)果，供試藥劑的濃度如下：80%代森錳鋅和72%甲霜·錳鋅可濕性粉劑6個濃度為：10、5、2.5、1.25、0.625、0312 5 mg/L；純品多菌靈為：5 000、1 667、556、185、62、21 mg/L；75%百菌清可濕性粉劑為10 000、3 333、1 111、370、123、41 mg/L。

將供試菌株接種到PDA平板培養(yǎng)基上，置于培養(yǎng)箱內(nèi) 25 ℃ 培養(yǎng)5～7 d，用打孔器打取直徑6 mm的菌餅接種于相應(yīng)濃度的含藥PDA平板培養(yǎng)基中央，每皿1枚，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)，每種藥劑每個濃度設(shè)3次重復(fù)，以加等量無菌水的平板培養(yǎng)基為對照；4 d或7 d后用十字交叉法測量菌落直徑，根據(jù)公式（1）計算各藥劑對病菌的抑制率，并通過DPS2000軟件對藥劑濃度和抑制率進行毒力回歸方程分析和計算EC50。

生長抑制率=對照直徑-處理直徑對照直徑-菌餅直徑×100%（1）

2結(jié)果與分析

2.1病原菌的鑒定

萵筍發(fā)病病葉上出現(xiàn)紅棕色至暗褐色壞死斑，中間有灰白色點，以其為中心有輪紋，整個病斑有圓形、近圓形或不規(guī)則形，直徑為2～8 mm，每張葉片上出現(xiàn)的病斑數(shù)目不等，少的幾個，多的十幾個甚至幾十個（圖1-A）。分離純化的菌絲在PDA培養(yǎng)基上生長，菌落圓形或近圓形，厚實，初期呈灰白色，3～4 d逐漸變?yōu)榛液志G色。整個菌落外圍灰白色至暗青褐色，由外往內(nèi)菌絲顏色逐漸加深，直至菌落中央的黑褐色，但接種點因長有較多氣生菌絲為灰白色（圖1-B）。顯微鏡下觀察顯示，該菌菌絲細長，有分枝，菌絲直徑為2.0～3.0 μm；分生孢子梗單生，頂端色稍淡，基部細胞稍大，頂端較寬，呈截形，分生孢子橢圓形或卵形，單生，淡褐色至褐色，無嘴喙，有縱橫分隔，成熟孢子表面有細疣（圖1-C、D）。根據(jù)以上形態(tài)特征，可知衡陽地區(qū)萵筍葉斑病的病原菌為微疣匍柄霉[Stemphylium chisha （Nish） Yannamoto]。

2.24種藥劑對病菌的抑制效果

藥劑處理葉斑病菌絲培養(yǎng)7 d后，結(jié)果顯示：在試驗濃度范圍內(nèi)，甲霜·錳鋅和代森錳鋅最高抑制率分別為59.68%和58.87%；而藥劑處理4 d的多菌靈、百菌清的最高抑制率分別為88.89%、80.56%（表1）。由此可知，所試各種濃度的藥劑對病原菌菌絲的生長都有不同程度的抑制作用。通過DPS2000軟件對藥劑濃度和抑制率進行相關(guān)性數(shù)據(jù)分析，得出甲霜·錳鋅、代森錳鋅、多菌靈和百菌清回歸方程并計算出各個藥劑的抑制中濃度分別為6.58、6.34、 458、2 107 mg/L （表2）。由此可知，在對萵筍葉斑病測試的4種藥劑中，代森錳鋅的抑菌效果最好，其次是甲霜·錳鋅，再次是多菌靈，最差的為百菌清。所以，4種殺菌劑對病原菌的毒力大小次序為：代森錳鋅>甲霜·錳鋅>多菌靈>百菌清（圖2）。表1殺菌劑對萵筍葉斑病菌絲生長的影響endprint

3結(jié)論與討論

經(jīng)過形態(tài)學(xué)鑒定發(fā)現(xiàn)，衡陽地區(qū)引起萵筍葉斑病的病原菌主要是微疣匍柄霉。藥劑篩選表明，代森錳鋅和甲霜·錳鋅對該病菌的抑制中濃度要遠小于百菌清和多菌靈。本研究結(jié)果為萵筍葉斑病的防治奠定理論基礎(chǔ)。

在對衡陽地區(qū)果蔬主要病害的調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，衡陽地區(qū)的萵筍葉部病害發(fā)生嚴重，成為影響萵筍產(chǎn)量和質(zhì)量的主要病害之一[2]。目前防治萵筍葉斑病推薦使用的農(nóng)藥為75%百菌清、50%異菌脲、40%克菌丹、50%甲基硫菌靈可濕粉劑[8]等，而本研究顯示代森錳鋅和甲霜·錳鋅同推薦藥劑百菌清相比效果更好。造成結(jié)果不一致的原因可能有兩個：一是不同地區(qū)的萵筍葉斑病病菌的對不同藥劑的敏感度存在差異；二是百菌清藥劑的長期使用使得萵筍葉斑病對其產(chǎn)生了部分抗性。由此看來，今后在防治萵筍葉斑病過程中，有必要對本試驗藥劑進行進一步的田間驗證試驗，找出更經(jīng)濟有效的藥劑，用于萵筍葉斑病害的防治，以降低藥劑用量，減少環(huán)境污染和防止病原菌抗藥性的產(chǎn)生。

在本試驗中，代森錳鋅和甲霜·錳鋅處理組是測定處理 7 d 的菌落直徑，而百菌清和多菌靈處理組是測定處理4 d的菌落直徑，是因為在預(yù)試驗中發(fā)現(xiàn)，百菌清和多菌靈藥劑處理菌絲4 d以后對菌絲的抑制率基本保持不變，因此對于EC50的計算沒有影響。另外，在藥劑預(yù)試驗中還測試70%甲基硫菌靈，發(fā)現(xiàn)該藥對萵筍葉斑病無抑制效果。

參考文獻：

[1]李忠瓊，林瑞超，傅文，等. 萵筍花化學(xué)成分的研究[J]. 中草藥，2001，32（2）：101-104.

[2]李玉中，劉先，潘悅，等. 衡陽地區(qū)果蔬主要病害的調(diào)查初報[J]. 天津農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，19（4）：86-88.

[3]方中達. 植病研究方法[M]. 3版.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1988：25-27.

[4]張?zhí)煊? 中國真菌志：第三十一卷暗色磚格分生孢子真菌26屬[M]. 北京：科學(xué)技術(shù)出版社，2009：198-199.

[5]楊成德，姜紅霞，陳秀蓉，等. 甘肅省馬鈴薯炭疽病的鑒定及室內(nèi)藥劑篩選[J]. 植物保護，2012，38（6）：127-133.

[6]陳愛昌，魏周全，駱得功，等. 馬鈴薯炭疽病發(fā)生情況及室內(nèi)藥劑篩選[J]. 植物保護，2012，38（5）：162-164.

[7]張瑾，徐秉良，梁巧蘭，等. 杏采后病害病原菌鑒定及室內(nèi)藥劑篩選[J]. 植物保護，2011，37（5）：118-123.

[8]黃華寧. 萵筍病蟲害防治不容忽視[J]. 科學(xué)種養(yǎng)，2009（4）：30.endprint

3結(jié)論與討論

經(jīng)過形態(tài)學(xué)鑒定發(fā)現(xiàn)，衡陽地區(qū)引起萵筍葉斑病的病原菌主要是微疣匍柄霉。藥劑篩選表明，代森錳鋅和甲霜·錳鋅對該病菌的抑制中濃度要遠小于百菌清和多菌靈。本研究結(jié)果為萵筍葉斑病的防治奠定理論基礎(chǔ)。

在對衡陽地區(qū)果蔬主要病害的調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，衡陽地區(qū)的萵筍葉部病害發(fā)生嚴重，成為影響萵筍產(chǎn)量和質(zhì)量的主要病害之一[2]。目前防治萵筍葉斑病推薦使用的農(nóng)藥為75%百菌清、50%異菌脲、40%克菌丹、50%甲基硫菌靈可濕粉劑[8]等，而本研究顯示代森錳鋅和甲霜·錳鋅同推薦藥劑百菌清相比效果更好。造成結(jié)果不一致的原因可能有兩個：一是不同地區(qū)的萵筍葉斑病病菌的對不同藥劑的敏感度存在差異；二是百菌清藥劑的長期使用使得萵筍葉斑病對其產(chǎn)生了部分抗性。由此看來，今后在防治萵筍葉斑病過程中，有必要對本試驗藥劑進行進一步的田間驗證試驗，找出更經(jīng)濟有效的藥劑，用于萵筍葉斑病害的防治，以降低藥劑用量，減少環(huán)境污染和防止病原菌抗藥性的產(chǎn)生。

在本試驗中，代森錳鋅和甲霜·錳鋅處理組是測定處理 7 d 的菌落直徑，而百菌清和多菌靈處理組是測定處理4 d的菌落直徑，是因為在預(yù)試驗中發(fā)現(xiàn)，百菌清和多菌靈藥劑處理菌絲4 d以后對菌絲的抑制率基本保持不變，因此對于EC50的計算沒有影響。另外，在藥劑預(yù)試驗中還測試70%甲基硫菌靈，發(fā)現(xiàn)該藥對萵筍葉斑病無抑制效果。

參考文獻：

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[7]張瑾，徐秉良，梁巧蘭，等. 杏采后病害病原菌鑒定及室內(nèi)藥劑篩選[J]. 植物保護，2011，37（5）：118-123.

[8]黃華寧. 萵筍病蟲害防治不容忽視[J]. 科學(xué)種養(yǎng)，2009（4）：30.endprint

3結(jié)論與討論

經(jīng)過形態(tài)學(xué)鑒定發(fā)現(xiàn)，衡陽地區(qū)引起萵筍葉斑病的病原菌主要是微疣匍柄霉。藥劑篩選表明，代森錳鋅和甲霜·錳鋅對該病菌的抑制中濃度要遠小于百菌清和多菌靈。本研究結(jié)果為萵筍葉斑病的防治奠定理論基礎(chǔ)。

在對衡陽地區(qū)果蔬主要病害的調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，衡陽地區(qū)的萵筍葉部病害發(fā)生嚴重，成為影響萵筍產(chǎn)量和質(zhì)量的主要病害之一[2]。目前防治萵筍葉斑病推薦使用的農(nóng)藥為75%百菌清、50%異菌脲、40%克菌丹、50%甲基硫菌靈可濕粉劑[8]等，而本研究顯示代森錳鋅和甲霜·錳鋅同推薦藥劑百菌清相比效果更好。造成結(jié)果不一致的原因可能有兩個：一是不同地區(qū)的萵筍葉斑病病菌的對不同藥劑的敏感度存在差異；二是百菌清藥劑的長期使用使得萵筍葉斑病對其產(chǎn)生了部分抗性。由此看來，今后在防治萵筍葉斑病過程中，有必要對本試驗藥劑進行進一步的田間驗證試驗，找出更經(jīng)濟有效的藥劑，用于萵筍葉斑病害的防治，以降低藥劑用量，減少環(huán)境污染和防止病原菌抗藥性的產(chǎn)生。

在本試驗中，代森錳鋅和甲霜·錳鋅處理組是測定處理 7 d 的菌落直徑，而百菌清和多菌靈處理組是測定處理4 d的菌落直徑，是因為在預(yù)試驗中發(fā)現(xiàn)，百菌清和多菌靈藥劑處理菌絲4 d以后對菌絲的抑制率基本保持不變，因此對于EC50的計算沒有影響。另外，在藥劑預(yù)試驗中還測試70%甲基硫菌靈，發(fā)現(xiàn)該藥對萵筍葉斑病無抑制效果。

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[8]黃華寧. 萵筍病蟲害防治不容忽視[J]. 科學(xué)種養(yǎng)，2009（4）：30.endprint