5—氨基乙酰丙酸對油菜幼苗抗冷性和抗氧化系統的影響

張治平+張麗麗

摘要：以油菜品種滬油15為材料，葉面噴施30 mg/L 5-氨基乙酰丙酸（ALA）4 d，再置于4 ℃低溫條件下處理 8 d，分析測定了低溫處理0、4、8 d及恢復 4 d后光合色素含量及SOD、CAT、APX、POD等抗氧化酶活性、脯氨酸含量、超氧陰離子（ O-2· ）生成速率及MDA含量等生理指標，研究了ALA對油菜幼苗抗冷性的影響及作用機制。結果表明，低溫脅迫下，噴施ALA明顯緩解了油菜葉片葉綠素a（Chl a）、葉綠素b（Chl a）和總葉綠素（Chl）含量的下降程度，增加了類胡蘿卜素（Car）的含量，顯著提高了SOD、CAT、APX和POD的活性和脯氨酸的含量，降低了O-2· 生成速率和MDA含量的上升幅度。低溫脅迫時間越長，ALA的作用效果越明顯，說明噴施ALA通過促進葉綠素的合成，提高油菜植株的抗氧化能力，降低活性氧的產生，減少膜脂過氧化的傷害程度，從而提高了油菜幼苗的抗冷性。另外，噴施ALA可以促進油菜幼苗在受到低溫傷害后迅速恢復。

關鍵詞：油菜；低溫脅迫；5-氨基乙酰丙酸；葉綠素；類胡蘿卜素；抗氧化酶；脯氨酸

中圖分類號： S634.301文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2014）02-0052-03

收稿日期：2013-07-23

基金項目：國家自然科學青年基金（編號：31101505）。

作者簡介：張治平（1982—），女，河南洛陽人，博士，主要從事蔬菜逆境生理和分子生物學研究。E-mail：zhangzp0422@163.com。油菜（Brassica napus L.）作為一種重要的油料作物，種植極為廣泛，遍及世界各地，我國油菜種植面積和產量均居世界第一位[1]。油菜是越冬作物，低溫已經成為影響其正常生長的主要限制因子，冬春季持續低溫凍害極易引起油菜葉片變黃、干枯、花蕾脫落、開花而不結實，一些嚴重凍害甚至可能造成整株死亡，導致油菜絕收，給油菜生產造成嚴重損失[1-2]。因此，提高油菜的耐低溫能力越來越為人們所關注。

5-氨基乙酰丙酸（ALA）是所有生物體內卟啉化合成的關鍵前體[3]，低濃度時，ALA能夠促進葉綠素（Chl）合成，調節植物生長發育，提高多種植物的抗冷性[4-7]。據報道，ALA顯著提高西瓜植株生長量，增強植株抵抗低溫弱光的能力[4]。沈奇等研究表明，ALA可以促進辣椒Chl的合成，增強光合作用，提高滲透調節物質含量和提高SOD、CAT和POD活性，維持膜系統的穩定性，從而緩解低溫脅迫對辣椒的傷害[5]。但是，噴施ALA提高油菜幼苗耐低溫能力的研究尚鮮有報道。為此，本研究以油菜為試驗材料，分析在4 ℃低溫脅迫下，噴施ALA對油菜葉片Chl和類胡蘿卜素（Car）含量、抗氧化酶活性、游離態脯氨酸含量、 O-2· 生成速率和MDA含量的影響，研究ALA提高油菜幼苗抗冷性的原因，以期為油菜生產提供技術支持。

1材料與方法

1.1供試材料與培養

本試驗以油菜品種滬油 15為材料。挑選飽滿的種子，用70%乙醇浸泡1 min，25%次氯酸鈉消毒10 min，蒸餾水沖洗3次。37 ℃暗培養出芽后，播種于營養缽中。營養土配制為蛭石 ∶黑土 ∶珍珠巖=18 ∶6 ∶1；培養條件設定晝/夜溫度為 （25±1） ℃/（15±1） ℃，光周期為16 h/8 h（晝/夜），光強為 300 μmol/（m2·s）。育苗期間正常管理，按照需要施肥和澆水。

1.2試驗處理

油菜幼苗培養至5葉1心期，選取生長一致的植株，用30 mg/L的ALA溶液噴施，并設清水對照。噴施時溶液中添加 0.01% Triton，均勻地噴灑葉片的正反面，以葉片滴水為噴施標準。ALA處理后4 d，放入人工氣候箱中進行低溫處理，溫度為4 ℃，光照條件和培養期間相同。低溫處理 8 d，之后轉移至晝/夜（25±1） ℃/（15±1） ℃溫度條件下，恢復 4 d。低溫處理0 d、4 d、8 d及恢復 4 d時分別取完全展開的第4、第5片真葉測定有關生理指標。

1.3試驗方法

1.3.1葉片光合色素含量的測定采用乙醇浸提法提取并測定油菜葉片Chl和Car的含量[8]。

1.3.2抗氧化酶活性測定SOD 活性測定采用氮藍四唑（NBT）光還原法[9]，以抑制反應50%為1個酶活力單位（U）；CAT活性測定采用紫外吸收法，以1 min D240 nm值減少0.01為1個酶活力單位（U）[10]；APX 活性測定參照Nakano等的方法[11]；POD 活性測定采用愈創木酚法[12]。

1.3.3 O-2· 生成速率和MDA含量測定O-2·生成速率測定采用α-萘胺法[13]；MDA含量的測定用硫代巴比妥酸（TBA）法[14]。

1.3.4游離態脯氨酸含量測定脯氨酸含量測定采用磺基水楊酸提取法[15]。

1.3.5統計分析采用Excel 2011和SAS軟件對數據進行統計分析和差異顯著性檢驗。

2結果與分析

2.1ALA對低溫脅迫下油菜幼苗光合色素含量的影響

此外，常溫條件下，噴施ALA對油菜葉片Car含量沒有顯著影響。低溫脅迫4 d，對照葉片Car含量增加，但沒有達到明顯差異；同對照相比，ALA預處理顯著增加了Car含量，Car含量提高了14.4%。經過低溫脅迫8 d，對照Car含量下降，但是ALA處理的Car含量仍然保持較高的水平。恢復后，對照Car含量的恢復到低溫處理前的81.7%；噴施ALA的Car含量恢復到低溫脅迫前水平（表1）。

2.1ALA對低溫脅迫下油菜抗氧化酶活性和脯氨酸含量的影響

常溫下，噴施ALA顯著增加了油菜葉片SOD、APX和POD的活性，而CAT的活性和脯氨酸的含量增加不明顯。經過4 ℃低溫處理，油菜葉片的SOD、APX、CAT、POD的活性和脯氨酸含量明顯增加，并且這種增加量隨著低溫脅迫時間的延長而升高；噴施ALA顯著增加了的油菜葉片SOD、APX、CAT、POD的活性和脯氨酸含量，低溫脅迫8 d時，ALA處理的 SOD、APX、CAT、POD的活性和脯氨酸含量最高。另外，與對照相比，低溫脅迫4 d時，ALA處理的SOD、CAT的活性和脯氨酸含量增加量最多，分別增加了22.6%、23.1%和184%，而APX和POD的活性則是在低溫脅迫8 d時提高得最多，分別提高了51.4%和30.9%。常溫恢復4 d，油菜葉片的SOD、APX、CAT和POD的活性下降到低溫處理前水平，噴施ALA的葉片SOD、APX、CAT和POD的活性仍然高于對照；但是脯氨酸含量保持較高的水平，各處理之間沒有明顯差異（表2）。

2.4ALA對低溫脅迫下油菜 O-2· 生成速率和MDA含量的影響

常溫條件下，噴施ALA對 O-2· 生成速率和MDA含量沒有明顯影響。低溫脅迫下，對照的 O-2· 生成速率和MDA含量升高，低溫脅迫4 d對照葉片 O-2· 生成速率和MDA含量分別上升了74.3%和55.3%；低溫脅迫8 d，則達到低溫處理前的2.85倍和2.56倍。ALA預處理能減輕油菜葉片 O-2· 生成速率和MDA含量的升高程度，低溫處理8 d時，表現得最明顯，同對照相比，噴施ALA的 O-2· 生成速率和MDA含量分別下降了32.3%和30.1%。經過4 d恢復， O-2· 生成速率和MDA含量開始下降，但只有噴施ALA的油菜葉片 O-2· 生成速率和MDA含量下降到低溫處理前水平（表3）。

3討論

低溫條件下植物體內產生大量的活性氧和自由基，可以引起葉綠素的破壞和分解[16-17]。研究表明，外源ALA可以

增加葉片Chl含量，提高植株的抗冷性[5-6]。另外，用含有ALA的肥料噴施蕓豆，2個月后，Chl含量仍然明顯高于對照[18]。本研究中，噴施ALA顯著提高了油菜葉片Chl a、Chl b 和Chl 的含量，這種增加效應隨著低溫脅迫持續時間的延長表現得更加顯著。經過常溫恢復后，ALA處理的油菜葉片Chl a、Chl b和Chl迅速恢復，說明ALA可以促進油菜葉片Chl的合成，并且ALA的這種效應具有長效性，一直持續存在于整個低溫脅迫和恢復過程中。

植物在正常代謝過程中和逆境脅迫下均能產生活性氧。正常情況下，植物體內產生的活性氧可以及時地被清除掉，不會對細胞產生傷害，但植物受到脅迫后，活性氧大量積累，導致膜脂過氧化的產生[5，16-17]。本研究中常溫條件下 O-2· 的生成速率和MDA含量比較低，噴施ALA對 O-2· 的生成速率和MDA含量的影響不明顯，說明常溫下，油菜細胞內自由基含量以及細胞膜脂損傷程度沒有顯著變化。油菜遭受低溫脅迫后，活性氧大量產生， O-2· 的生成速率和MDA含量迅速升高，脅迫時間越久， O-2· 的生成速率和MDA含量增加量越多。噴施ALA顯著降低了 O-2· 的生成速率和MDA含量，低溫脅迫8 d，ALA的作用效果最明顯，表明低溫脅迫打破了油菜細胞中活性氧產生和清除的動態平衡，使 O-2· 的生成速率迅速增加，并引起細胞膜氧化損傷，低溫持續時間越長，細胞膜損傷越嚴重。噴施ALA降低了油菜 O-2· 的生成速率，緩解了膜脂過氧化的產生程度。沈奇等研究表明，低溫脅迫下，ALA處理辣椒幼苗 O-2· 的生成速率和MDA含量均呈先急劇上升又下降的趨勢[5]；劉衛琴等等認為正常生長條件下ALA顯著降低了草莓葉片的MDA含量[19]；而康瑯等發現ALA對低溫脅迫下西瓜幼苗的MDA含量沒有影響[4]。這些結果表明，ALA對氧化脅迫調節具有復雜性，ALA處理降低了 O-2· 的生成速率，但對MDA的影響需要進一步研究。

植物在遭受低溫脅迫后，活性氧大量積累，植物會誘導一系列抗氧化保護酶活性迅速提高來清除過多的活性氧，緩解低溫對其造成的傷害。SOD、CAT、APX和 POD是細胞內清除活性氧的主要酶促保護系統。SOD可以催化 O-2· 生成H2O2，產生的 H2O2又可由 CAT、APX和POD進一步分解形成 H2O和O2，它們共同防御活性氧對細胞的傷害[16]。ALA是血紅素合成的前體，外源ALA可以增加亞鐵血紅素的含量。而CAT、POD和APX同屬于亞鐵血紅素蛋白酶類。本研究中噴施ALA顯著提高SOD、CAT、APX和POD活性與含量，這與前人在西瓜、辣椒、西葫蘆和黃瓜等上的研究結果[4-7]是一致的。由此說明 ALA提高抗氧化酶活性，增加植株的抗氧化能力，在增強植物抗冷性中發揮著重要的作用。

此外，植物體內還存在一些如Car和脯氨酸等非酶促抗氧化保護物質，用來抵御逆境脅迫對細胞造成的傷害。Car存在于葉綠體內，在所有的單線態氧（1O2）猝滅系統中，具有最重要的意義。正常狀態下，植物體內脯氨酸含量很低，但受到逆境脅迫時，脯氨酸就會大量積累，改善細胞滲透調節能力，清除活性氧，減輕細胞膜氧化損傷[16-17]。本研究中，油菜在正常條件下培養，Car和脯氨酸的含量較低，但是當遇到低溫脅迫時，Car和脯氨酸含量顯著上升，在恢復過程中，隨著細胞 O-2· 的生成速率和MDA含量的下降，Car和脯氨酸的含量也開始下降，說明Car和脯氨酸在油菜響應低溫脅迫、清除活性氧以避免細胞遭到氧化脅迫中發揮了重要作用。劉衛琴等認為ALA處理對正常條件生長草莓葉片的Car含量沒有明顯影響[19]，本研究常溫下噴施ALA的Car的含量沒有變化的結果與其一致。另外，本研究發現ALA處理增加了低溫脅迫下油菜葉片Car含量。低溫脅迫下，Car可以保護Chl分子，避免Chl被氧化，增強植株抗低溫能力[15]。這可能是ALA處理的油菜葉片能保持較高的葉綠素含量與抗冷性增強的一個原因。谷氨酸是脯氨酸和ALA合成的共同前體，Averina等認為鹽脅迫下，加入外源ALA后，內源ALA的合成下降，使谷氨酸轉向合成脯氨酸，脯氨酸大量積累，從而增加了大麥的耐鹽性[20]。尹璐璐等報道ALA提高黃瓜幼苗的抗冷性，與脯氨酸積累量增加、MDA含量減少有關[7]。本研究中ALA處理提高低溫脅迫下油菜葉片的脯氨酸含量和增加油菜耐低溫能力的結果與其類似。

綜上所述，噴施ALA增強了油菜植株的抗氧化能力，降低了 O-2· 的生成速率，抑制膜脂過氧化的產生，促進了低溫脅迫下油菜Chl的合成。噴施ALA明顯提高油菜幼苗的抗冷性，并能夠促進油菜在受到低溫脅迫后迅速恢復。

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