柳枝稷種子組培快繁技術

楊冉+黃萍+祁珊珊+楊淞惠+杜道林

摘要：柳枝稷（Panicum virgatum L.）是一種理想的能源作物。以柳枝稷成熟種子為外植體，探索愈傷誘導過程中最佳外源激素配比，從而建立柳枝稷種子組培快繁體系。結果表明，不同濃度配比的激素愈傷誘導率差異較大，以MS培養基為基本培養基，添加 6 mg/L 2，4-D、1 mg/L 6-BA、0.6 mg/L NAA進行誘導，愈傷誘導率可高達82%。

關鍵詞：柳枝稷；愈傷誘導；植株再生

中圖分類號：S943.1文獻標志碼：A文章編號：1002-1302（2014）02-0046-03

收稿日期：2013-07-03

基金項目：國家自然科學基金 （編號：31170386、31200316）；江蘇省科技支撐計劃（編號：BE2011369、BE2012419）；中國博士后科學基金（編號：2012M520999）；江蘇大學高級人才基金 （編號：09JDG020、11JDG150）。

作者簡介：楊冉（1988—），男，河南信陽人，碩士，主要從事能源植物新品種培育研究。E-mail：Ranyang0804@163.com。

通信作者：杜道林，博士，研究員，主要從事生態學研究。Tel：（0511）88790955；E-mail：ddl@ujs.edu.cn。柳枝稷（Panicum virgatum L.）為多年生草本C4植物，在北美洲廣泛種植[1]。柳枝稷植株高大，具有根系發達、防風固沙能力強、耐瘠薄等優點，是沙漠綠化的理想植物[2]。柳枝稷可合成燃料乙醇、甲醇、沼氣、氫氣等，由于其能源產出率高，在乙醇生產過程中易降解，被美國政府確定為替代玉米生產燃料乙醇的首選能源植物[3]。保存并快速繁殖優質材料是現代生物育種技術的重要研究內容。Xi等研究發現，柳枝稷是一種異型雜交的多倍體單子葉植物，具有高度的自交不親和性[4]。因此，通過遺傳轉化獲得具有高遺傳力的柳枝稷轉基因品種變得尤為重要，轉基因育種的前提是建立高效的植物組織培養體系。現有的柳枝稷組培研究中，外植體多為葉片、莖尖、節間及幼穗，以這些材料作為外植體，愈傷誘導率普遍較低，且容易受生長周期及季節限制。本研究以柳枝稷成熟種子為材料，探索愈傷誘導過程中最佳外源激素配比，從而建立柳枝稷種子組培快繁體系，旨在為開發利用柳枝稷資源提供依據。

1材料與方法

1.1材料

柳枝稷品種為Alamo（北京市農林科學院），用自來水沖洗脫殼后的成熟種子，去掉雜質，用無菌水浸泡12 h，沖洗后風干，置于4 ℃冰箱中備用。

1.2方法

1.2.1培養基配制愈傷組織誘導及分化以MS為基礎培養基，采用3因素3水平進行試驗（表1），pH值為8.0。生根培養基為1/2MS+NAA（0.4、0.8、1.2、1.6 mg/L）+3% 蔗糖+0.75% 瓊脂，pH值為8.0。配制完成后，121 ℃高壓滅菌15 min，待溫度冷卻至50～60 ℃時搖勻，倒入培養皿中，置于超凈臺風干備用。

1.2.2種子處理挑選干燥飽滿的種子，首先用6% NaClO溶液消毒2.5 h，輕輕攪動使NaClO與種子充分接觸，然后用無菌水清洗3～5遍，浸泡12 h。之后用6% NaClO溶液消毒20 min，用無菌水清洗種子3～5遍[5]。在無菌條件下，將處理好的種子接種到愈傷誘導培養基中進行培養。

1.2.3培養條件選擇同一批成熟種子作為外植體進行愈傷組織誘導及分化試驗，每處理重復5次，每個培養皿中接種30粒種子，置于光照培養箱中培養。培養30～45 d后，選擇株高為2～4 cm的再生苗，切下幼苗轉入生根培養基中，繼續置于光照培養箱中培養，每個組培瓶接種12個外植體，每濃度重復4次，培養10～15 d。愈傷組織誘導培養基試驗因素及水平見表1。GZX-300BS-4光照培養箱（上海新苗醫療器械制造有限公司）培養溫度設置為24 ℃，光照培養時間為16 h/d，光照強度為12 000 lx。

1.2.4生長指標測定接種后，每3 d統計1次胚芽數目、胚根出現時間及數目、愈傷組織出現時間及數目等指標。培養30～45 d后，統計種子發芽率及愈傷誘導率，確定最佳愈傷組織誘導培養基激素配比。在誘導培養基上培養一段時間后觀察愈傷組織的生長情況，觀察并統計分化出的不定芽生

2結果與分析

2.1不同激素配比對種子萌發時間及萌發率的影響

由表2可知，培養5～7 d后，大多數種子都能在愈傷組織誘導培養基上萌發，且不同濃度激素對柳枝稷種子的萌發時間及萌發率均有顯著影響。當2，4-D濃度為6 mg/L、6-BA 濃度為1.0 mg/L、NAA濃度為0.6 mg/L時，種子接種后3 d即開始萌發，萌發率達82%。當2，4-D濃度為 6 mg/L、6-BA濃度為1.5 mg/L、NAA濃度為1.2 mg/L時，種子萌發時間延遲，接種后7 d才開始萌發，且萌發率僅為35%。由此可知，柳枝稷種子萌發的最佳培養基為MS+2，4-D 6 mg/L+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.6 mg/L。

2.2不同激素配比對愈傷組織誘導及分化培養的影響

經消毒處理的成熟種子培養5 d后，部分培養基上開始有愈傷組織形成，隨后逐漸變大，并且隨著愈傷組織的增大其表面逐漸變得干燥，質地緊密結實，顏色多為黃色、嫩綠色（圖1-a）。當2，4-D濃度為2mg/L、6-BA濃度為

0.5 mg/L、NAA濃度為1.2 mg/L時，形成愈傷組織所需的時間最長，即培養12 d后才能觀察到愈傷組織的形成。不同激素配比下，外植體愈傷組織的長勢也有顯著差別（圖1-b）。在愈傷誘導培養基上培養25 d后，不同激素配比處理下愈傷組織在色澤、大小等指標方面差異較大，愈傷誘導率最高可達82%，最低僅為35%（表2）。一部分愈傷組織色澤淡黃，體積較小且表面干燥疏松；另一部分愈傷組織色澤嫩綠，體積較大且表面緊實，具有較強的再分化能力，可用于誘導成苗。這些生長狀態良好的愈傷組織培養一段時間后體積逐漸增大，且伴隨出現一些白色顆粒狀胚狀體。繼續培養10 d后，有些原本白色的胚狀體凸起，分化為嫩綠色的幼芽（圖1-c）。隨著培養時間的延長，新形成的幼芽逐漸變綠，并且直立生長，有的幼芽長勢較快，接種到培養基上15 d后可長至2～3 cm。體積較小的愈傷組織接種一段時間后，分化出一些零星的幼芽，隨后幼芽停止生長。將切割后的分化組織接種到新培養基上培養20 d，有的芽能長出長約4～6 cm的新葉，并從嫩綠色變成翠綠色（圖1-d）。愈傷組織誘導及分化的最佳培養基為MS+6 mg/L 2，4-D+1 mg/L 6-BA+0.6 mg/L NAA+3% 蔗糖+0.75% 瓊脂，pH值為8.0。

2.3不同濃度NAA對不定芽生根的影響

在愈傷組織誘導及分化的最佳培養基上培養40 d后，愈傷組織開始分化出大小不一的不定芽。選擇長勢較一致的不定芽切割后接種到含有不同濃度NAA的生根培養基上進行生根誘導（圖1-e）。結果表明，當 NAA濃度為 0.8 mg/L 時，生根時間最短，7 d后即可觀察到白色凸起并逐漸形成新根，生根率可達90%以上（表3），每棵再生苗均能誘導出 15～20 條新生根（圖1-f）。當NAA濃度過低（0.4 mg/L）或者過高（1.6 mg/L）時，新根都會延遲出現。在生根的同時，新生苗新葉長勢良好（圖1-g），平均長約 10 cm，部分甚至高達20 cm（圖1-g）。

2.4煉苗

當大部分新生苗長出數量不一的新根后，將組培瓶上的封口膜去掉，繼續在培養箱中培養2～3 d，隨后將培養基取出置于室溫下培養，并在培養基表面加入少許無菌水，繼續培養3 d后，將新苗從培養基中輕輕取出，避免損傷根部。用無菌水將幼苗表面的培養基沖洗干凈，移栽至花盆中繼續培養，用塑料薄膜覆蓋以防止水分大量流失。每天用無菌水澆灑新苗，待新苗長勢穩定后，將花盆搬至室外繼續培養煉苗（圖1-h）。當培養條件適合時，大部分幼苗都能正常存活，并且穩定生長（圖1-i）。

3結論

Gupta等研究發現，2，4-D、TDZ結合使用對柳枝稷愈傷組織的形成起促進作用[6]。Denchev等認為，添加不同濃度的2，4-D及6-BA對柳枝稷的愈傷誘導、分化再生有明顯影響[7]。傳統的柳枝稷組培步驟較繁瑣，包括愈傷誘導、繼代、分化及生根等環節，耗時較長，且產率較低。許文志等利用柳枝稷成熟種子作為外植體進行愈傷組織的誘導及分化，研究滅菌處理及不同濃度激素組合對愈傷組織誘導及分化的影響，包括愈傷組織誘導、分化、生根等環節，耗時較長[8]。在愈傷誘導過程中，添加一定濃度的6-BA可改變愈傷組織的質量，提高植物分化再生頻率[9]。有研究表明，2，4-D對愈傷組織形成有比較明顯的促進作用，很少被植物細胞所代謝[10]，且不同濃度的 2，4-D與其他一些細胞分裂素結合，可以建立高效組培體系[11]。NAA是廣譜型植物生長調節劑，能促進細胞分裂和擴大，誘導分化組織形成不定根[12]。本研究表明，不同濃度配比的激素愈傷誘導率差異較大，以MS培養基為基本培養基，添加 6 mg/L 2，4-D、1 mg/L 6-BA、0.6 mg/L NAA進行愈傷組織誘導，愈傷誘導率可高達82%。愈傷組織誘導增殖后，在最佳激素配比培養基上可直接進行分化培養，能進一步分化出大量新生芽。本方法有效縮短了再生時間，節約了試驗成本，提高了效率。室內煉苗 7 d 后，將柳枝稷新生苗移至室外培養，可正常存活。

參考文獻：

[1]王勇鋒，柴乖強，徐開杰，等. 柳枝稷成熟胚愈傷組織誘導的影響因素[J]. 西北農業學報，2012，21（6）：140-145.

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[8]許文志，張新全，黃琳凱，等. 柳枝稷種子愈傷組織誘導及分化[J]. 草業科學，2012，29（1）：45-50.

[9]李會珍，劉培培，張志軍，等. 紫蘇子葉組織培養植株再生的研究[J]. 安徽農業科學，2011，39（22）：13369-13371.

[10]Arnold S V，Sabala I，Bozhkow P，et al. Developmental pathways of somatic embryogenesis[J]. Plant Cell Tissue and Organ Culture，2002，69（3）：233-249.

[11]Gupta S D，Conger B V. In vitro differentiation of multiple shoot clumps from intact seedlings of switchgrass[J]. In Vitro Cellular & Developmental Biology：Plant，1998，34（3）：196-202.

[12]Ramamoorthy R，Kumar P P. A simplified protocol for genetic transformation of switchgrass（Panicum virgatum L.）[J]. Plant Cell Reports，2012，31（10）：1923-1931.

2.3不同濃度NAA對不定芽生根的影響

在愈傷組織誘導及分化的最佳培養基上培養40 d后，愈傷組織開始分化出大小不一的不定芽。選擇長勢較一致的不定芽切割后接種到含有不同濃度NAA的生根培養基上進行生根誘導（圖1-e）。結果表明，當 NAA濃度為 0.8 mg/L 時，生根時間最短，7 d后即可觀察到白色凸起并逐漸形成新根，生根率可達90%以上（表3），每棵再生苗均能誘導出 15～20 條新生根（圖1-f）。當NAA濃度過低（0.4 mg/L）或者過高（1.6 mg/L）時，新根都會延遲出現。在生根的同時，新生苗新葉長勢良好（圖1-g），平均長約 10 cm，部分甚至高達20 cm（圖1-g）。

2.4煉苗

當大部分新生苗長出數量不一的新根后，將組培瓶上的封口膜去掉，繼續在培養箱中培養2～3 d，隨后將培養基取出置于室溫下培養，并在培養基表面加入少許無菌水，繼續培養3 d后，將新苗從培養基中輕輕取出，避免損傷根部。用無菌水將幼苗表面的培養基沖洗干凈，移栽至花盆中繼續培養，用塑料薄膜覆蓋以防止水分大量流失。每天用無菌水澆灑新苗，待新苗長勢穩定后，將花盆搬至室外繼續培養煉苗（圖1-h）。當培養條件適合時，大部分幼苗都能正常存活，并且穩定生長（圖1-i）。

3結論

Gupta等研究發現，2，4-D、TDZ結合使用對柳枝稷愈傷組織的形成起促進作用[6]。Denchev等認為，添加不同濃度的2，4-D及6-BA對柳枝稷的愈傷誘導、分化再生有明顯影響[7]。傳統的柳枝稷組培步驟較繁瑣，包括愈傷誘導、繼代、分化及生根等環節，耗時較長，且產率較低。許文志等利用柳枝稷成熟種子作為外植體進行愈傷組織的誘導及分化，研究滅菌處理及不同濃度激素組合對愈傷組織誘導及分化的影響，包括愈傷組織誘導、分化、生根等環節，耗時較長[8]。在愈傷誘導過程中，添加一定濃度的6-BA可改變愈傷組織的質量，提高植物分化再生頻率[9]。有研究表明，2，4-D對愈傷組織形成有比較明顯的促進作用，很少被植物細胞所代謝[10]，且不同濃度的 2，4-D與其他一些細胞分裂素結合，可以建立高效組培體系[11]。NAA是廣譜型植物生長調節劑，能促進細胞分裂和擴大，誘導分化組織形成不定根[12]。本研究表明，不同濃度配比的激素愈傷誘導率差異較大，以MS培養基為基本培養基，添加 6 mg/L 2，4-D、1 mg/L 6-BA、0.6 mg/L NAA進行愈傷組織誘導，愈傷誘導率可高達82%。愈傷組織誘導增殖后，在最佳激素配比培養基上可直接進行分化培養，能進一步分化出大量新生芽。本方法有效縮短了再生時間，節約了試驗成本，提高了效率。室內煉苗 7 d 后，將柳枝稷新生苗移至室外培養，可正常存活。

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[12]Ramamoorthy R，Kumar P P. A simplified protocol for genetic transformation of switchgrass（Panicum virgatum L.）[J]. Plant Cell Reports，2012，31（10）：1923-1931.

2.3不同濃度NAA對不定芽生根的影響

在愈傷組織誘導及分化的最佳培養基上培養40 d后，愈傷組織開始分化出大小不一的不定芽。選擇長勢較一致的不定芽切割后接種到含有不同濃度NAA的生根培養基上進行生根誘導（圖1-e）。結果表明，當 NAA濃度為 0.8 mg/L 時，生根時間最短，7 d后即可觀察到白色凸起并逐漸形成新根，生根率可達90%以上（表3），每棵再生苗均能誘導出 15～20 條新生根（圖1-f）。當NAA濃度過低（0.4 mg/L）或者過高（1.6 mg/L）時，新根都會延遲出現。在生根的同時，新生苗新葉長勢良好（圖1-g），平均長約 10 cm，部分甚至高達20 cm（圖1-g）。

2.4煉苗

當大部分新生苗長出數量不一的新根后，將組培瓶上的封口膜去掉，繼續在培養箱中培養2～3 d，隨后將培養基取出置于室溫下培養，并在培養基表面加入少許無菌水，繼續培養3 d后，將新苗從培養基中輕輕取出，避免損傷根部。用無菌水將幼苗表面的培養基沖洗干凈，移栽至花盆中繼續培養，用塑料薄膜覆蓋以防止水分大量流失。每天用無菌水澆灑新苗，待新苗長勢穩定后，將花盆搬至室外繼續培養煉苗（圖1-h）。當培養條件適合時，大部分幼苗都能正常存活，并且穩定生長（圖1-i）。

3結論

Gupta等研究發現，2，4-D、TDZ結合使用對柳枝稷愈傷組織的形成起促進作用[6]。Denchev等認為，添加不同濃度的2，4-D及6-BA對柳枝稷的愈傷誘導、分化再生有明顯影響[7]。傳統的柳枝稷組培步驟較繁瑣，包括愈傷誘導、繼代、分化及生根等環節，耗時較長，且產率較低。許文志等利用柳枝稷成熟種子作為外植體進行愈傷組織的誘導及分化，研究滅菌處理及不同濃度激素組合對愈傷組織誘導及分化的影響，包括愈傷組織誘導、分化、生根等環節，耗時較長[8]。在愈傷誘導過程中，添加一定濃度的6-BA可改變愈傷組織的質量，提高植物分化再生頻率[9]。有研究表明，2，4-D對愈傷組織形成有比較明顯的促進作用，很少被植物細胞所代謝[10]，且不同濃度的 2，4-D與其他一些細胞分裂素結合，可以建立高效組培體系[11]。NAA是廣譜型植物生長調節劑，能促進細胞分裂和擴大，誘導分化組織形成不定根[12]。本研究表明，不同濃度配比的激素愈傷誘導率差異較大，以MS培養基為基本培養基，添加 6 mg/L 2，4-D、1 mg/L 6-BA、0.6 mg/L NAA進行愈傷組織誘導，愈傷誘導率可高達82%。愈傷組織誘導增殖后，在最佳激素配比培養基上可直接進行分化培養，能進一步分化出大量新生芽。本方法有效縮短了再生時間，節約了試驗成本，提高了效率。室內煉苗 7 d 后，將柳枝稷新生苗移至室外培養，可正常存活。

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