保加利亞乳桿菌微囊化活菌制劑的研究

關海濱，董至恒，包小妹，石瑞文，喬俊纏

（內蒙古醫科大學藥學院，內蒙古呼和浩特010110）

保加利亞乳桿菌微囊化活菌制劑的研究

關海濱，董至恒，包小妹，石瑞文，喬俊纏*

（內蒙古醫科大學藥學院，內蒙古呼和浩特010110）

制備保加利亞乳桿菌的微囊化制劑。液體發酵法制備保加利亞乳桿菌，以海藻酸鈉為囊材制備保加利亞乳桿菌微囊。微囊化保加利亞乳桿菌的凍干存活率為45.07%，與傳統方法（凍干存活率為44.35%）相比，差異無統計學意義。人體胃液和腸液耐受性試驗結果顯示，在人體胃液中微囊化的菌體3 h后菌體存活率達到71.16%，而對照的存活率僅為16.47%；在人體腸液中微囊化的菌體6h后菌體存活率達到71.67%，而對照的存活率僅為30.46%。微囊起到了保護保加利亞乳桿菌免受人體胃液和腸液破壞的作用。

保加利亞乳桿菌；微囊；海藻酸鈉；存活率

微生態制劑因其具有“患病治病，未病防病，無病保健”的效果。已經廣泛應用于保健食品和藥品中[1]。微生態制劑，是通過加入對人體有益的微生物，從而調整胃腸道微生態的平衡，控制菌群失調、促進內環境的穩定、提高人體的健康水平[2]。保加利亞乳桿菌（Lactobacillusdelbrueckiisubsp.bulgaricus）對人體的健康起到非常重要的作用，保加利亞乳桿菌屬于德氏乳桿菌屬，保加利亞亞種，保加利亞乳桿菌繁衍至今已經遍布全世界[3]。由于保加利亞乳桿菌具有促進胃腸道消化吸收、增加免疫、抗癌等重要的生理功能，因此被規定為可用于保健食品和藥品的益生菌菌種之一，在醫藥、乳品、飼料添加劑、保健品等領域廣泛應用[4-6]。目前一些大品牌的酸奶、奶油、干酪以及臨床上應用的微生態制劑培菲康、金雙歧都含有保加利亞乳桿菌，隨著生物技術的進一步發展，保加利亞乳桿菌的性能將會被進一步開發[7-8]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌源

保加利亞乳桿菌（Lactobacillusdelbrueckiisubsp. bulgaricus）：中國工業微生物菌種保藏管理中心。

1.1.2 試劑和儀器

MRS液體培養基：葡萄糖1.0%、蛋白胨1.0%、酵母膏1.0%、牛肉粉0.5%、乙酸鈉0.5%、檸檬酸三銨0.5%、吐溫-80 0.1%、MgCl20.05%、MnCl20.02%、K2HPO40.05%，用5.0%的NaOH調節pH為7.0~7.2。MRS固體培養基：MRS液體培養基加入1.5%的瓊脂，121℃滅菌30min，至4℃冰箱保存。凍干保護劑：乳糖50%、脫脂奶粉25%，115℃滅菌20min，至4℃冰箱保存。模擬人體胃液：NaCl0.3%、KCl0.2%、胃蛋白酶0.5%，用HCl調節pH為2.0，0.22μm微孔濾膜過濾滅菌。模擬人體腸液：KH2PO40.5%、胰蛋白酶0.3%，用NaOH調節pH為8.0，0.22μm微孔濾膜過濾滅菌。Thermo Scientific 1029厭氧培養箱：美國Thermo公司；CX21-BIM顯微鏡：日本OLYMPUS公司；FD-2.5E凍干機：美國SIM公司。

1.2 方法

1.2.1 保加利亞乳桿菌的培養及發酵液活菌數的測定

菌種的擴大培養采取三級發酵培養，具體操作過程為：將一支凍干菌種接入裝量為60mLMRS液體培養基的100mL三角瓶中，37℃厭氧培養12 h后取出，作為一級種子；一級種子按5%的接種量接入裝量為150mLMRS液體培養基的250mL三角瓶中，37℃厭氧培養12 h后取出，作為二級種子；二級種子按5%的接種量分別接入6個裝量為400mLMRS液體培養基的500mL三角瓶中，37℃厭氧培養12 h后取出，得到三級發酵液，平板計數法檢測發酵液活菌數，方法參照GB/T4789.2-2003《食品衛生微生物學檢驗菌落總數測定》。

1.2.2 微囊的制備及凍干微囊與凍干菌粉存活率的比較

取1 L發酵液8 000 r/min離心30min，棄去上清液，將離心得到的菌泥與30mL凍干保護劑混合，加入到60 mL海藻酸鈉（3.0%）溶液中，混勻，滴入若干1.1%的CaCl2，固化30min，過濾收集微囊，冷凍干燥，得到保加利亞乳桿菌微囊27.4 g。稱取凍干微囊1.0 g，加入到10mL 0.12mol/LNa2HPO4和0.04mol/L檸檬酸的緩沖液（pH 7.2）中，劇烈震蕩15min使微囊充分溶解，梯度稀釋，平板計數法檢測活菌數。保加利亞乳桿菌的凍干微囊存活率等于凍干微囊的總活菌數比發酵液總活菌數。

取1 L發酵液8 000 r/min離心30min，棄去上清液，將離心得到的菌泥與30mL凍干保護劑混合，冷凍干燥，得到保加利亞乳桿菌乳桿菌菌粉21.8 g。稱取凍干菌粉1.0 g，加入到10mL 0.12mol/LNa2HPO4和0.04mol/L檸檬酸的緩沖液（pH 7.2）中，劇烈震蕩15min使菌粉充分溶解，梯度稀釋，平板計數法檢測活菌數。保加利亞乳桿菌的凍干菌粉存活率等于凍干菌粉的總活菌數比發酵液總活菌數。

1.2.3 保加利亞乳桿菌微囊在模擬人體胃液中的存活試驗

取5 g保加利亞乳桿菌微囊加入到50mL模擬人體胃液中，37℃水浴，分別在0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5和3.0 h取樣。以相同活菌總數的保加利亞乳桿菌凍干菌粉4.04 g為對照，平板計數法檢測人體胃液中活菌數的變化。

1.2.4 保加利亞乳桿菌微囊在模擬人體腸液中的存活試驗

取5 g保加利亞乳桿菌微囊加入到50mL模擬人體腸液中，37℃水浴，分別在0、1、2、3、4、5、6h取樣。以相同活菌總數的保加利亞乳桿菌凍干菌粉4.04 g為對照，平板計數法檢測人體腸液中活菌數的變化。

2 結果

2.1 保加利亞乳桿菌發酵液活菌數的測定

經測定，保加利亞乳桿菌發酵液活菌數為（15.73± 0.91）×108CFU/mL（n=4）。

2.2 凍干微囊與凍干菌粉存活率的比較

經測定，保加利亞乳桿菌凍干微囊活菌數為（258.75±7.93）×108CFU/g（n=4）。凍干微囊存活率=（258.75×108CFU/g×27.4 g）/（15.73×108CFU/mL× 1 000mL）=45.07%。經測定，保加利亞乳桿菌凍干菌粉活菌數為（320.00±8.29）×108CFU/g（n=4）。凍干菌粉存活率=（320.00×108CFU/g×21.8 g）/（15.73× 108CFU/mL×1 000mL）=44.35%。

保加利亞乳桿菌凍干微囊的存活率為45.07%，使用傳統方法制備的保加利亞乳桿菌凍干菌粉的存活率為44.35%，兩者比較并未有明顯差別，可見，微囊對凍干存活率的影響較小。

2.3 保加利亞乳桿菌微囊在模擬人體胃液中存活試驗

由表1、2可知，在模擬人體胃液中，微囊化的保加利亞乳桿菌活菌數緩慢下降，3 h后活菌數由（254.00±5.60）×108CFU/g（n=4）降低至（180.75±3.59）× 108CFU/g（n=4），存活率達到71.16%。而直接加入保加利亞乳桿菌菌粉，其活菌數快速下降，3 h后活菌數由（258.00±7.39）×107CFU/g（n=4）降低至（42.50±4.80）× 107CFU/g（n=4），存活率為16.47%。

2.4 保加利亞乳桿菌微囊在模擬人體腸液中存活試驗

由表3、4可知，在模擬人體腸液中，微囊化的保加利亞乳桿菌活菌數緩慢下降，6 h后活菌數由（255.00± 7.07）×107CFU/g（n=4）降低至（182.75±4.34）×107CFU/g（n=4），存活率達到71.67%。而直接加入保加利亞乳桿菌菌粉，其活菌數快速下降，6 h后活菌數由（255.25±9.54）×107CFU/g（n=4）降低至（77.75±8.62）×107CFU/g（n=4），存活率為30.46%。

表1 保加利亞乳桿菌微囊對模擬人體胃液的耐受性Table1 Toleranceof Lactobacillusbulgaricus m icrocapsule to artificialgastric juice

表2 保加利亞乳桿菌菌粉對模擬人體胃液的耐受性Table2 Toleranceof Lactobacillusbulgaricus powder to artificialgastric juice

表3 保加利亞乳桿菌微囊對模擬人體腸液的耐受性Table3 Toleranceof Lactobacillusbu lgaricus m icrocapsule to artificial intestinal juice

表4 保加利亞乳桿菌菌粉對模擬人體腸液的耐受性Table4 Toleranceof Lactobacillusbulgaricus powder to artificial intestinal juice

3 討論

微囊是利用天然或合成的高分子材料作為囊殼，將固態或液態藥物包裹成為微型膠囊，微囊可以掩蓋食品、藥物的不良氣味，還能提高其穩定性，減少食品、藥物對胃腸的刺激[9，11]。本實驗使用海藻酸鈉作為囊殼材料，將保加利亞乳桿菌包裹在微囊內。通過冷凍干燥得到保加利亞乳桿菌微囊，微囊的凍干存活率達到45.07%，而使用傳統方法制得的保加利亞乳桿菌菌粉凍干存活率為44.35%，兩者的凍干存活率沒有明顯差別，可見微囊化對保加利亞乳桿菌的凍干存活率沒有影響。

含益生菌類的食品、藥品的活性關鍵在于菌體是否存活，在人體內，結腸的環境適合細菌生存，是腸道細菌的主要棲息地，但口服含益生菌類的食品、藥品必須經過胃和小腸，胃液的強酸性和所含的胃蛋白酶能殺死大多數細菌，腸當中的胰蛋白酶也會殺死大量細菌[12-14]。本實驗中，以微囊包裹保加利亞乳桿菌，通過模擬人體胃液和腸液實驗，保加利亞乳桿菌微囊可以很好的抵御酸、堿環境以及胃蛋白酶和胰蛋白酶。在模擬人體胃液中，大多數益生菌難以耐受pH 2.0的酸性環境和胃蛋白酶的作用，在作用3 h后保加利亞乳桿菌微囊存活率為71.16%，對照保加利亞乳桿菌菌粉的存活率為16.47%，微囊使保加利亞乳桿菌在胃液中的存活率明顯提高。在模擬人體腸液中，pH 8.0的堿性環境和胰蛋白酶的作用也會造成菌體的大量死亡，在作用6 h后保加利亞乳桿菌微囊存活率為71.67%，對照保加利亞乳桿菌菌粉的存活率為30.46%，微囊使保加利亞乳桿菌在腸液中的存活率明顯提高。

市售含益生菌類的食品、藥品大多是片劑、膠囊和散劑，菌體經過胃腸時很難受到保護，能存活下來的菌體很少，而微囊能提高菌體的存活率。因此，益生菌微囊的開發和利用對食品、藥品、飼料添加劑和保健品新產品的研發有廣闊的前景。

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Research on the M icroencapsulation of Lactobacillus bulgaricus

GUANHai-bin，DONGZhi-heng，BAOXiao-mei，SHIRui-wen，QIAO Jun-chan*

（Pharmacy College，Inner Mongolia Medical University，Hohhot010110，Inner Mongolia，China）

To preparemicroencapsulation of Lactobacillusbulgaricus.Liquid fermentation technologywasused to prepare Lactobacillus bulgaricus，sodium alginate asmicro-capsule material.Freeze dry survival rate of microencapsulation Lactobacillus bulgaricus was 45.07%，no significant difference was found compare to traditionalmethod（survival rate44.35%）.Mimichuman gastric juiceand intestinal juice tolerance testshowed that，microcapsules survival in human gastric juice 3 hours，cell survival ratewas 71.16%，while the control survival ratewas16.47%.In the human intestinal juice，after 6 hoursmicroencapsulated cell survival ratewas 71.67%，while the control survival rate was 30.46%.Microcapsule plays a protective role for Lactobacillus bulgaricus from humangastricand intestinal juiceeffect.

Lactobacillusbulgaricus；microcapsules；alginate；survival rate

2014-05-27

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.23.017

內蒙古自治區高等學校科學研究項目（NJZY14139）；內蒙古自治區自然科學基金項目（2011MS1211）

關海濱（1982—），男（滿），講師，碩士研究生，從事微生物藥物、食品及制劑方面的研究。

*通信作者：喬俊纏，男（漢），教授，本科，從事微生物藥物、生態學方面的研究。