超高壓輔助物理法提取綠豆活性蛋白的研究

田海娟，王維堅，*，張亞楠

（1.吉林工商學院食品工程學院，吉林長春130062；2.糧油食品深加工吉林省高等學校重點實驗室，吉林長春130062；3.北京古船油脂有限責任公司，北京100076）

超高壓輔助物理法提取綠豆活性蛋白的研究

田海娟1，2，王維堅1，2，*，張亞楠3

（1.吉林工商學院食品工程學院，吉林長春130062；2.糧油食品深加工吉林省高等學校重點實驗室，吉林長春130062；3.北京古船油脂有限責任公司，北京100076）

采用超高壓技術提取綠豆活性蛋白，采用單因素試驗與正交試驗法對綠豆中活性蛋白的超高壓提取工藝進行優選，綠豆活性蛋白提取率為指標，考察超高壓壓力、保壓時間、固液比、提取溫度對綠豆活性蛋白提取率的影響。結果顯示，超高壓壓力300MPa、保壓時間6min、提取溫度40℃、固液比1∶15（g/mL），綠豆活性蛋白的提取率可達79.2%。試驗結果表明，綠豆蛋白提取液對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌有一定的抑制作用。超高壓提取方法得率高、提取時間短，是一種提取綠豆中活性蛋白的適宜方法。

超高壓技術；綠豆活性蛋白；正交試驗；提取率

綠豆，別名植豆、青小豆、吉豆。綠豆含有豐富的蛋白質、淀粉、維生素、人體必需的各種氨基酸和鈣、鐵等礦物質[1-2]。我國是綠豆生產大國、出口大國和消費大國[3]。我國綠豆年均種植面積近100萬畝，年總產量達100萬t以上；綠豆還是我國重要的出口商品，年出口原綠豆約2.0萬t。目前，加工綠豆粉絲的傳統工藝主要是針對提高綠豆淀粉的應用而設計的，其淀粉提取率低，而忽略了綠豆蛋白的開發與利用，把它作為廢料或者牲畜飼料，從而造成綠豆蛋白資源浪費，研究表明，綠豆中蛋白質含量高達19.5%～33.1%，蛋白質功效比（PER）高（1.87），且氨基酸種類齊全，尤其以賴氨酸含量較為豐富，接近雞蛋蛋白質賴氨酸含量。從應用價值來看，天然的綠豆蛋白具有明顯的開發優勢，綠豆蛋白具有優良的溶解性、乳化性和發泡性等功能特性，是作為蛋白補充劑和食品添加劑的絕好原料，在肉類產品和面制品中添加綠豆蛋白，不僅可改善食品的品質，還可增加食品的營養價值[4-5]。在食品加工業的面制品、肉制品、乳制品和飲料中的應用前景十分廣闊。

超高壓技術（ultra high pressure processing，UHP），又稱為高靜壓技術，是一種以水或其他液體作為傳壓介質，對置于彈性密封容器內的食品進行100MPa以上高壓處理的高新技術，具有殺菌、鈍酶、輔助浸提和改善食品功能特性等作用[6]。國內外學者己先后開展了超高壓技術在食品的殺菌與貯藏保鮮，果醬、果汁、肉制品、水產品的加工，食品物性和酒類品質的改良等方面的研究與應用開發工作[7]，并取得了較好的效果。本實驗采用廉價的水作為提取劑，并利用超高壓技術，通過調節壓力、固液比、保壓時間和提取溫度而得到提取率高的綠豆活性蛋白提取液。該方法對水進行循環利用，縮短提取時間，降低能耗，降低生產成本，無污水排放，避免環境污染。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

綠豆；牛肉膏；蛋白胨；蒸餾水；大腸桿菌；金黃色葡萄球菌；滅菌鍋；打孔器；培養箱；漿渣分離K600（3205）；膠體磨802-2型；離心機；DFZ-系列低溫粉碎機：江陰市益江藥華機械有限公司，凱氏定氮儀KDY-9830，100目篩；冰箱；超高冷等靜壓機HPB-A2（天津市華泰森淼生物工程技術有限公司；pHS-3C精密pH計：上海雷磁儀器廠；LPG-25高速離心噴霧干燥器：常州翔波機械制造廠；其他實驗玻璃儀器。

1.2 方法

1.2.1 提取工藝

綠豆→常溫加水浸泡12 h[8]→加水研磨，反復磨3次→超高壓處理→過濾（100目篩）→離心（3000 r/min，5min）→綠豆蛋白提取液

1.2.2 超高壓提取綠豆活性蛋白

稱取一定量的綠豆漿渣[9]，加入不同體積的蒸餾水，混合成懸濁液；裝入聚乙烯塑料袋，真空包裝，包裝后浸泡于高壓容器的傳壓介質油中，高壓處理懸濁液，再用100目篩過濾，去除固體顆粒后，離心取上清液獲得提取液，提取3次，合并提取液，減壓濃縮，計算綠豆活性蛋白提取率。

1.2.3 蛋白質測定方法

凱式定氮法（GB/T 5009.5-2003《食品中蛋白質的測定》）。

1.2.4 綠豆活性蛋白提取率的確定

準確稱取綠豆m（g），依據凱式定氮法計算綠豆中的蛋白質含量X（g/100 g）；在最佳工藝條件下進行提取綠豆蛋白，測得提取液體積為V（mL），其中含蛋白質為C（g/mL），經計算綠豆活性蛋白得率為：

1.2.5 綠豆活性蛋白的抑菌性測定

1.2.5.1 培養基的制備

牛肉膏0.5 g；蛋白胨1 g；氯化鈉0.5 g；瓊脂2 g；蒸餾水100mL；pH7.0～7.2；滅菌105℃，25min。

1.2.5.2 供試菌株懸浮液的制備

分別挑選預先進行菌種斜面活化的金黃色葡萄菌種和大腸桿菌制成菌懸液，然后分別用無菌水稀釋五個濃度梯度，使其含菌體為107CFU/mL~108CFU/mL，即得供試菌種。將各種菌的菌懸液貼好標簽備用。

1.2.5.3 抑菌試液的制備

綠豆蛋白提取液用滅菌雙蒸水按1∶5稀釋，充分混勻，得1.0 g/mL原液。每種提取液分別貼好標簽備用。

1.2.5.4 打孔法

在各平皿內分別加0.1mL菌懸液，用特制玻璃棒將菌液涂布均勻，每皿加入20mL培養基，再用打孔器在各皿中打5個直徑為5mm圓孔，每孔相隔一定距離，以防止其相互影響，再用少量未冷卻的培養基填封孔底，冷卻后，每孔加入不同提取液并做標記，其中中間的圓孔加入0.1mL生理鹽水做空白對照，每種提取液重復2個皿。最后，37℃恒溫箱中培養24 h，測定抑菌圈大小。

1.2.5.5 紙片法

在各平皿內分別加0.1mL菌懸液，用特制玻璃棒將菌液涂布均勻，每皿加入20mL培養基，待培養基凝固后，用鑷子夾取直徑為1 cm的濾紙片蘸取不同濃度的提取液，編號1、2、3、4號，5號放置蘸取生理鹽水的濾紙片做空白對照，每種提取液重復2個皿。最后，37℃恒溫箱中培養24 h，測定抑菌圈大小。

2 結果與討論

2.1 單因素對提取綠豆蛋白質的影響

2.1.1 壓力對綠豆蛋白質提取率的影響

高壓能破壞植物的細胞壁和胞內膜，壓力是影響超高壓提取的主要因素。高壓能使提取溶劑與細胞的各組分充分接觸，以達到快速提取的目的。試驗分別采用150、200、250、300、350、400MPa超高壓處理，保壓時間為6min，固液比1∶15（g/mL），提取溫度為40℃，連續提取3次，合并浸提液，用凱式定氮儀測定出提取液中蛋白質含量，計算出提取率，結果見圖1。

圖1 壓力對綠豆蛋白提取率的影響Fig.1 Protein extraction rateofm ung bean under different pressure

由圖1可知，壓力在150MPa～300MPa之間，綠豆活性蛋白提取率隨壓力的增加而提高；壓力高于300MPa，提取率變化緩慢。超高壓提取是先對物料加壓，保持一定時間后，然后急速泄壓，造成細胞內外的壓力梯度劇增，從而使細胞中的內含物釋放出來。若大于300MPa時，細胞被破壞，綠豆活性蛋白提取率變化趨于平緩。因此選用250、300、350MPa作為正交試驗中壓力的3個水平。

2.1.2 固液比對提取蛋白質提取率的影響

將綠豆漿渣在300MPa，保壓時間為6min，提取溫度為40℃，固液比分別為1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25條件下，連續提取3次，合并提取液，計算出提取率，結果見圖2。

圖2 固液比對提取率的影響Fig.2 Protein extraction rateofm ung bean under different ratio of solid to liquid

由圖2可知，固液比為1∶5～1∶25范圍內時，隨著加入的提取溶劑量的增加，提取液中綠豆活性蛋白的提取率也增加，當固液比達到1∶15后，綠豆活性蛋白提取率增加緩慢。在實際生產中，提取溶劑添加比例高，不僅消耗大量的溶劑，而且也降低了提取液中有效成分的濃度，在下一步的分離純化過程耗能提高。由此，從單因素試驗結果分析，并與實際生產相結合考慮，固液比為1∶15左右提取效果較好。因此，正交試驗中選擇固液比1∶10、1∶15、1∶20作為三個水平。

2.1.3 提取溫度對綠豆蛋白提取率的影響

分別在不同溫度情況下，將綠豆漿渣以300MPa高壓處理6min，固液比1∶15（g/mL），連續提取3次，合并提取液，依據1.2.4計算公式得到綠豆蛋白的提取率，結果見圖3。

圖3 溫度對綠豆蛋白提取率的影響Fig.3 Protein extraction rateofmung bean under different temperature

由圖3可知，隨著提取溫度逐漸升高，綠豆活性蛋白質提取率也隨之增高，當溫度達到40℃時綠豆蛋白的提取率達到最高；溫度繼續升高，綠豆蛋白的提取率隨之下降，溫度從40℃提高到50℃，提取率下降比較顯著；溫度大于50℃，綠豆蛋白的提取率下降趨于緩慢。溫度高有利于蛋白質溶解，蛋白質的提取率較高，但溫度過高也會引起蛋白質變性而使提取率降低。因此，選擇提取溫度為40℃左右較適宜。正交試驗選擇30、40、50℃作為中溫度的3個水平。

2.1.4 保壓時間對綠豆蛋白質提取率的影響

分別將綠豆漿渣以固液比為1∶15（g/mL），提取溫度為40℃，300 MPa高壓，處理時間為2、4、6、8、10min，連續提取3次，合并提取液，依據1.2.4計算公式計算其提取率，結果見圖4。

圖4 保壓時間對綠豆蛋白提取率的影響Fig.4 Protein extraction rateofmung bean under different holding time

由圖4可知，保壓時間在6min以內，綠豆活性蛋白提取率隨時間增加而增加，超過6min后，隨著保壓時間的延長，綠豆活性蛋白提取率變化趨于平緩，變化不明顯。這與高壓對綠豆活性蛋白提取率的影響一致，保壓時間的6min內處理，細胞的細胞壁和細胞膜逐步被破壞，超過6min，細胞被破壞，時間對綠豆活性蛋白提取率的影響就不顯著。正交試驗選擇4、6、8min作為保壓時間的3個水平。

2.2 提取工藝條件的優化

依據單因素的結果，設計L9（34）四因素三水平正交優化試驗，以綠豆活性蛋白提取率為指標，每個試驗重復兩次，考察壓力、固液比、保壓時間及提取溫度對綠豆活性蛋白提取率的影響，因素與水平的設計見表1。正交試驗結果見表2。

表1 正交因素水平表Table1 Orthogonal factors level tab le

表2 正交試驗結果Table2 The resu ltsof orthogonal test

通過極差分析可得，各因素對蛋白提取率影響的主次順序為：D＞C＞A＞B，即提取溫度＞保壓時間＞壓力＞固液比。根據平均值k1、k2、k3和極差R確定最優組合是A2B3C2D2，即壓力300MPa、固液比1∶10、保壓時間6min、提取溫度40℃，綠豆活性蛋白提取率可達79.2%。經重復試驗驗證，該方案可行，能適用于實際運用中。

2.3 抑菌試驗分析

通過打孔試驗和紙片法試驗對照結果表3與表4所示。

表3 打孔法測得抑菌圈的平均直徑Table3 Theaverage diameter of bacteriostatic ring by punching method cm

表4 濾紙片法測得抑菌圈的直徑Table4 Theaveragediameter of bacteriostatic ring by filter method cm

通過打孔法和紙片法對比結果顯示，生理鹽水對兩種菌種均無抑菌作用，而綠豆蛋白提取液對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均有抑制作用，且提取液的濃度越高抑菌作用越明顯，其對大腸桿菌的抑制作用更明顯。

3 結論

通過對壓力、固液比、保壓時間、提取溫度的單因素實驗和正交試驗，得到超高壓輔助物理法提取綠豆活性蛋白的最佳工藝條件為壓力300MPa、保壓時間6min、固液比1∶15、提取溫度為40℃，綠豆活性蛋白提取率可達79.2%，且所提取的綠豆活性蛋白對金黃色葡萄球菌具有抑菌作用。超高壓提取綠豆活性蛋白，時間短、提取率高。

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Research on Extraction of M ung Bean Active Protein by Ultra High Pressure-assisted Physical M ethod

TIANHai-juan1，2，WANGWei-jian1，2，*，ZHANGYa-nan3

（1.Branch of Food Engineering，Jilin Business and Technology College，Changchun 130062，Jilin，China；2.Key Laboratory of Grain and Oil Processing of Jilin province，Jilin Business and Technology College，Changchun 130062，Jilin，China；3.Beijing GuChuan Edible Oil CO.，Ltd.，Beijing 100076，China）

To optimize technique conditionsofultra high pressure-assisted extraction forMung bean protein，in order to improve Mung bean protein.Withmung bean protein extraction rate as indicators，single-factormethod wasused tooptimize the techniqueparameters.On thebasisofsingle-factorexperiment，L9（34）Orthogonalexperimentwasused to furtheroptimize the technique parameters．The resultsshowed that theoptimum extraction parameterswereultrahigh pressure 300MPa，theholding time6min，solid-liquid radio1∶15（g/mL），extraction temperature40℃.Theextraction rateofproteinoptimized byorthogonaltestwas79.2%.Experimentsasloproved thatthemungbean protein inhibitted thegrowthof Escherichiacoli and Staphylococcusaureus.The techniqueparametersofultrahigh pressure-assisted extraction forMungbean protein are rapid，scientific and effective.

ultrahigh pressure technology；mungbean protein；orthogonal test；extraction ratio

2014-02-08

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.23.004

吉林省教育廳項目（吉教科合字[2010]第226號）

田海娟（1980—），女（漢），講師，碩士，研究方向：農產品加工與資源利用。

*通信作者：王維堅（1967—），女，教授，碩士，研究方向：糧油食品。