鐵皮石斛叢生芽增殖和生長(zhǎng)影響因素的研究

蘇江+岑忠用+吳月圓+覃勇榮

摘要：以鐵皮石斛叢生芽為材料，通過研究不同基本培養(yǎng)基、碳源及天然有機(jī)復(fù)合物等若干因子對(duì)鐵皮石斛叢生芽增殖分化及壯苗生根的影響，篩選出適宜鐵皮石斛組培苗快速繁殖的最佳配方，試圖建立鐵皮石斛組培苗的無菌繁殖系。研究結(jié)果表明，鐵皮石斛叢生芽增殖分化的最適培養(yǎng)基為N6培養(yǎng)基，植株生長(zhǎng)健壯；最適碳源為蔗糖；壯苗生根的最適配方為MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L+25%香蕉汁+3%白糖，生根率較高。

關(guān)鍵詞：鐵皮石斛；叢生芽；增殖；生長(zhǎng)

中圖分類號(hào)： S567.23+9.043文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2014）02-0036-03

收稿日期：2013-10-28

基金項(xiàng)目：廣西教育廳項(xiàng)目（編號(hào)：2013YB207）；河池學(xué)院重點(diǎn)項(xiàng)目（編號(hào)：2012YBZ-N002）；廣西高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室桂西北特色資源研究與開發(fā)實(shí)驗(yàn)室資助項(xiàng)目（編號(hào)：桂教科研[2010]6號(hào)）。

作者簡(jiǎn)介：蘇江（1980—），女，廣西寧明人，碩士，講師，從事植物組織培養(yǎng)及相關(guān)生物技術(shù)研究。E-mail：suppersujiang@sina.com。石斛屬是蘭科植物中一個(gè)較大的屬，全世界約110種，廣泛分布于亞洲、歐洲和大洋洲等地。我國有74種2變種，分布于秦嶺以南諸地區(qū)，尤其以云南南部為多。《中國藥典》2005年版記載，能夠入藥的石斛有5種，其中以鐵皮石斛（Dendrobium candidum）最為名貴。鐵皮石斛為蘭科石斛屬多年生草本植物，俗稱鐵皮楓斗，又名黑節(jié)草，因其表皮呈鐵綠色而得名[1]。鐵皮石斛主要生長(zhǎng)在高山峻嶺懸崖峭壁和巖石縫隙中，是一種分布在巖溶地區(qū)的珍貴中藥材植物，民間有“救命仙草”“中華仙草”的美稱[2]。鐵皮石斛是一種生長(zhǎng)緩慢、自身繁殖能力很低的蘭科附生植物，對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境要求十分嚴(yán)格。鐵皮石斛從開花授粉至果實(shí)成熟約需6個(gè)月，一般借助昆蟲或外力異花傳粉，因而授粉不良，結(jié)果甚少。在自然條件下，種子萌發(fā)因缺乏營養(yǎng)物質(zhì)，需與真菌共生，以獲得養(yǎng)分的供給才能完成萌發(fā)，發(fā)芽率極低。鐵皮石斛種子極小，不含胚乳，自然繁殖十分困難，加上人為的過度采挖和破壞生境，其資源已瀕臨滅絕[3-6]。目前，為滿足國內(nèi)外市場(chǎng)對(duì)石斛藥源的需要，須通過人工培育的方法快速繁殖鐵皮石斛。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

由河池學(xué)院植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室提供的鐵皮石斛無菌芽。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1不同基本培養(yǎng)基對(duì)鐵皮石斛叢生芽增殖和生長(zhǎng)的影響設(shè)3個(gè)處理，即以MS、1/2MS、N6為基本培養(yǎng)基，添加激素6-BA 1.0 mg/L、NAA 0.5 mg/L，白糖3%，瓊脂7.0 g/L，pH值5.8～6.0，每個(gè)處理0.5 L。

1.2.2不同碳源對(duì)鐵皮石斛增殖叢生芽和生長(zhǎng)的影響設(shè)3個(gè)處理，即以白糖3%、蔗糖3%、葡萄糖3%為碳源，添加至MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L培養(yǎng)基上，瓊脂 7.0 g/L，pH值5.8～6.0，每個(gè)處理0.5 L。

1.2.3不同附加物及濃度對(duì)鐵皮石斛叢生芽增殖和壯苗生根的影響設(shè)6個(gè)處理，即以香蕉汁、馬鈴薯汁各15%、20%、25%為附加物，添加至MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L 培養(yǎng)基上，瓊脂7.0 g/L，pH值5.8～6.0，每個(gè)處理 0.5 L。

1.3測(cè)定指標(biāo)及方法

1.3.1石斛芽的增殖率增殖系數(shù)=培養(yǎng)45 d后獲得不定芽數(shù)/接種外植體數(shù)。

1.3.2株高隨機(jī)抽取3瓶材料，在無菌超凈臺(tái)上用加熱器高溫滅菌的鑷子將石斛苗從培養(yǎng)瓶中取出，每瓶約取出10株，置于培養(yǎng)皿中待用。用尺子測(cè)量30株石斛苗的株高，記錄數(shù)據(jù)。

1.3.4根數(shù)及根長(zhǎng)隨機(jī)抽取3瓶材料，在無菌超凈臺(tái)上從培養(yǎng)瓶中取出約30株石斛苗，放至培養(yǎng)皿中待用。用鑷子輔助數(shù)出肉眼可見的根數(shù)，并用尺子測(cè)量其根長(zhǎng)，記錄數(shù)據(jù)。

2結(jié)果與分析

2.1不同基本培養(yǎng)基對(duì)叢生芽增殖和生長(zhǎng)的影響

試驗(yàn)結(jié)果表明，在添加激素6-BA 1.0 mg/L、NAA 0.5 mg/L，白糖3%，pH值5.8等同等條件下，鐵皮石斛叢生芽增殖率從高到低排列為N6>1/2MS>MS，即以N6為基本培養(yǎng)基時(shí)最適合鐵皮石斛叢生芽的增殖，增殖率最高，增殖系數(shù)達(dá)2.0，且芽葉片顏色濃綠，長(zhǎng)勢(shì)均勻整齊。1/2MS的增殖效果也很明顯，增殖系數(shù)為1.9，但是石斛芽較矮小，顏色略帶黃色。MS的效果最差，增殖率最低，但是MS培養(yǎng)基的石斛芽最健壯，莖的生長(zhǎng)最明顯（表1、圖1、圖2、圖3）。

2.2不同碳源對(duì)鐵皮石斛叢生芽增殖和生長(zhǎng)的影響

試驗(yàn)結(jié)果表明：不同的碳源對(duì)鐵皮石斛的增殖和叢生芽

生長(zhǎng)有不同的效果（表2），其中蔗糖的增殖效果最好，葡萄糖次之，白糖的增殖效果最差。另外，從叢生芽生長(zhǎng)的情況看，以蔗糖為碳源的叢生芽長(zhǎng)勢(shì)均勻、整齊健壯且顏色濃綠，平均株高達(dá)到2.42 cm；以白糖為碳源的叢生芽長(zhǎng)勢(shì)與以蔗糖為碳源的叢生芽長(zhǎng)勢(shì)相似，但平均株高僅為1.83 cm；以葡萄糖為碳源的叢生芽長(zhǎng)勢(shì)最差，其莖較細(xì)，顏色淺綠。

2.3不同附加物對(duì)鐵皮石斛叢生芽增殖和壯苗生根的影響

不同的附加物對(duì)鐵皮石斛叢生芽增殖和壯苗生根具有不同程度的影響。由表3可知，馬鈴薯汁更有利于促進(jìn)叢生芽的增殖，增殖系數(shù)均達(dá)2.1以上，這有利于短期快速獲得大量的試管苗，但褐化現(xiàn)象較嚴(yán)重（圖4、圖5、圖6），對(duì)誘導(dǎo)生根也具有抑制作用。其中以馬鈴薯汁25%最有利于鐵皮石斛的增殖，但芽長(zhǎng)勢(shì)較弱。不同濃度香蕉汁增殖效果均比馬鈴薯汁的差，且不同濃度的增殖效果差異不明顯。

3討論

3.1鐵皮石斛叢生芽增殖和生長(zhǎng)的最適基本培養(yǎng)基

本研究結(jié)果顯示，N6為基本培養(yǎng)基時(shí)鐵皮石斛叢生芽增殖效果較好，這與曾宋君等對(duì)5種石斛進(jìn)行離體培養(yǎng)得出石

斛的通用最適培養(yǎng)基是改良N6培養(yǎng)基的結(jié)果[7]一致。MS為基本培養(yǎng)基時(shí)叢生芽增殖效果最差，但MS培養(yǎng)基對(duì)石斛莖生長(zhǎng)有較好的促進(jìn)作用，這與郭洪波的研究結(jié)果[8]相同。在比較MS、1/2MS、N6不同培養(yǎng)基對(duì)鐵皮石斛生長(zhǎng)的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，增殖明顯的石斛芽莖生長(zhǎng)不明顯，反之，莖生長(zhǎng)較好的增殖率不高。所以研究不同問題時(shí)，要根據(jù)需要選擇適合的培養(yǎng)基，本研究認(rèn)為N6培養(yǎng)基最適合鐵皮石斛的增殖，而MS培養(yǎng)基較有利于莖的生長(zhǎng)。

3.2鐵皮石斛組培苗生長(zhǎng)的最適碳源

在比較不同碳源對(duì)鐵皮石斛生長(zhǎng)的影響中，試驗(yàn)結(jié)果表明，蔗糖對(duì)石斛芽的增殖效果最好，長(zhǎng)勢(shì)整齊健壯，對(duì)株高的影響優(yōu)于白糖和葡萄糖，這與魏梅娟等的研究結(jié)果[9]一致。從鐵皮石斛的生長(zhǎng)情況看，本研究還發(fā)現(xiàn)以白糖為碳源的叢生芽長(zhǎng)勢(shì)與以蔗糖為碳源的叢生芽長(zhǎng)勢(shì)相似，以葡萄為碳源的叢生芽長(zhǎng)勢(shì)最差，其莖較細(xì)，顏色淺綠。因此，本研究認(rèn)為大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)鐵皮石斛組培苗時(shí)，在盡量保證苗質(zhì)量的前提下，為了降低生產(chǎn)成本，以白糖作為碳源較合適。

3.3鐵皮石斛壯苗生根的最適附加物及濃度

天然有機(jī)物是植物組織培養(yǎng)中常用的添加物[10]，在長(zhǎng)期的組織培養(yǎng)實(shí)踐中，人們發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基內(nèi)加入某些適當(dāng)?shù)奶烊挥袡C(jī)添加物，能夠增強(qiáng)培養(yǎng)物的生長(zhǎng)、分化效應(yīng)，促進(jìn)培養(yǎng)物更好地存活、發(fā)育。植物組織培養(yǎng)中常用的天然有機(jī)添加物包括椰乳、香蕉汁、蘋果汁、番茄汁、胡蘿卜汁、馬鈴薯汁等[11]。本研究以香蕉汁和馬鈴薯汁為附加物，結(jié)果表明，香蕉汁和馬鈴薯汁對(duì)鐵皮石斛叢生芽增殖和壯苗生根培養(yǎng)具有不同的影響。從增殖效果來看，馬鈴薯汁處理更有利于叢生芽的增殖，并以25%馬鈴薯汁的增殖效果最佳，這將有利于短期快速獲得大量的試管苗；但馬鈴薯汁處理褐化現(xiàn)象較嚴(yán)重。增殖效果較差的是15%香蕉汁和20%香蕉汁。從根的

生長(zhǎng)情況來看，香蕉汁處理的生根率、根數(shù)、根長(zhǎng)都優(yōu)于馬鈴薯汁處理，在培養(yǎng)65 d時(shí)，3個(gè)香蕉汁處理的平均根長(zhǎng)都在 0.65 cm 以上，其中以添加25%香蕉汁處理的效果最好，其根長(zhǎng)達(dá)0.84 cm。從叢生芽的生長(zhǎng)情況來看，香蕉汁和馬鈴薯汁對(duì)鐵皮石斛叢生芽的生長(zhǎng)都有促進(jìn)作用，在培養(yǎng)65 d時(shí)各處理的平均株高達(dá)到1.86～2.1 cm，且香蕉汁處理的平均株高均稍大于馬鈴薯汁處理，其中25%香蕉汁處理的株高最大，為2.1 cm。綜合試驗(yàn)結(jié)果，本研究認(rèn)為，香蕉汁比馬鈴薯汁更有利于鐵皮石斛壯苗生根培養(yǎng)，且以25%香蕉汁處理效果最佳，這可能是香蕉汁和馬鈴薯汁所含的成分不同所致，有關(guān)這方面還需進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

[1]王憲楷，趙同芳. 石斛屬植物的化學(xué)成分與中藥石斛[J]. 中國藥學(xué)雜志，1986，21（11）：666-669.

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[7]曾宋君，程式君，張京麗，等. 五種石斛蘭的胚培養(yǎng)及其快速繁殖研究[J]. 園藝學(xué)報(bào)，1998，25（1）：76-81.

[8]郭洪波. 鐵皮石斛（Dendrobium candidum）組培快繁及其抗癌作用的研究[D]. 沈陽：沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)，2008：3-10.

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[11]劉曉燕，向青云，劉玲玲，等. 基本培養(yǎng)基及附加物對(duì)蝴蝶蘭原球莖增殖效果的影響[J]. 種子，2005，24（6）：18-20，26.

本研究結(jié)果顯示，N6為基本培養(yǎng)基時(shí)鐵皮石斛叢生芽增殖效果較好，這與曾宋君等對(duì)5種石斛進(jìn)行離體培養(yǎng)得出石

斛的通用最適培養(yǎng)基是改良N6培養(yǎng)基的結(jié)果[7]一致。MS為基本培養(yǎng)基時(shí)叢生芽增殖效果最差，但MS培養(yǎng)基對(duì)石斛莖生長(zhǎng)有較好的促進(jìn)作用，這與郭洪波的研究結(jié)果[8]相同。在比較MS、1/2MS、N6不同培養(yǎng)基對(duì)鐵皮石斛生長(zhǎng)的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，增殖明顯的石斛芽莖生長(zhǎng)不明顯，反之，莖生長(zhǎng)較好的增殖率不高。所以研究不同問題時(shí)，要根據(jù)需要選擇適合的培養(yǎng)基，本研究認(rèn)為N6培養(yǎng)基最適合鐵皮石斛的增殖，而MS培養(yǎng)基較有利于莖的生長(zhǎng)。

3.2鐵皮石斛組培苗生長(zhǎng)的最適碳源

在比較不同碳源對(duì)鐵皮石斛生長(zhǎng)的影響中，試驗(yàn)結(jié)果表明，蔗糖對(duì)石斛芽的增殖效果最好，長(zhǎng)勢(shì)整齊健壯，對(duì)株高的影響優(yōu)于白糖和葡萄糖，這與魏梅娟等的研究結(jié)果[9]一致。從鐵皮石斛的生長(zhǎng)情況看，本研究還發(fā)現(xiàn)以白糖為碳源的叢生芽長(zhǎng)勢(shì)與以蔗糖為碳源的叢生芽長(zhǎng)勢(shì)相似，以葡萄為碳源的叢生芽長(zhǎng)勢(shì)最差，其莖較細(xì)，顏色淺綠。因此，本研究認(rèn)為大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)鐵皮石斛組培苗時(shí)，在盡量保證苗質(zhì)量的前提下，為了降低生產(chǎn)成本，以白糖作為碳源較合適。

3.3鐵皮石斛壯苗生根的最適附加物及濃度

天然有機(jī)物是植物組織培養(yǎng)中常用的添加物[10]，在長(zhǎng)期的組織培養(yǎng)實(shí)踐中，人們發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基內(nèi)加入某些適當(dāng)?shù)奶烊挥袡C(jī)添加物，能夠增強(qiáng)培養(yǎng)物的生長(zhǎng)、分化效應(yīng)，促進(jìn)培養(yǎng)物更好地存活、發(fā)育。植物組織培養(yǎng)中常用的天然有機(jī)添加物包括椰乳、香蕉汁、蘋果汁、番茄汁、胡蘿卜汁、馬鈴薯汁等[11]。本研究以香蕉汁和馬鈴薯汁為附加物，結(jié)果表明，香蕉汁和馬鈴薯汁對(duì)鐵皮石斛叢生芽增殖和壯苗生根培養(yǎng)具有不同的影響。從增殖效果來看，馬鈴薯汁處理更有利于叢生芽的增殖，并以25%馬鈴薯汁的增殖效果最佳，這將有利于短期快速獲得大量的試管苗；但馬鈴薯汁處理褐化現(xiàn)象較嚴(yán)重。增殖效果較差的是15%香蕉汁和20%香蕉汁。從根的

生長(zhǎng)情況來看，香蕉汁處理的生根率、根數(shù)、根長(zhǎng)都優(yōu)于馬鈴薯汁處理，在培養(yǎng)65 d時(shí)，3個(gè)香蕉汁處理的平均根長(zhǎng)都在 0.65 cm 以上，其中以添加25%香蕉汁處理的效果最好，其根長(zhǎng)達(dá)0.84 cm。從叢生芽的生長(zhǎng)情況來看，香蕉汁和馬鈴薯汁對(duì)鐵皮石斛叢生芽的生長(zhǎng)都有促進(jìn)作用，在培養(yǎng)65 d時(shí)各處理的平均株高達(dá)到1.86～2.1 cm，且香蕉汁處理的平均株高均稍大于馬鈴薯汁處理，其中25%香蕉汁處理的株高最大，為2.1 cm。綜合試驗(yàn)結(jié)果，本研究認(rèn)為，香蕉汁比馬鈴薯汁更有利于鐵皮石斛壯苗生根培養(yǎng)，且以25%香蕉汁處理效果最佳，這可能是香蕉汁和馬鈴薯汁所含的成分不同所致，有關(guān)這方面還需進(jìn)一步研究。

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[11]劉曉燕，向青云，劉玲玲，等. 基本培養(yǎng)基及附加物對(duì)蝴蝶蘭原球莖增殖效果的影響[J]. 種子，2005，24（6）：18-20，26.

本研究結(jié)果顯示，N6為基本培養(yǎng)基時(shí)鐵皮石斛叢生芽增殖效果較好，這與曾宋君等對(duì)5種石斛進(jìn)行離體培養(yǎng)得出石

斛的通用最適培養(yǎng)基是改良N6培養(yǎng)基的結(jié)果[7]一致。MS為基本培養(yǎng)基時(shí)叢生芽增殖效果最差，但MS培養(yǎng)基對(duì)石斛莖生長(zhǎng)有較好的促進(jìn)作用，這與郭洪波的研究結(jié)果[8]相同。在比較MS、1/2MS、N6不同培養(yǎng)基對(duì)鐵皮石斛生長(zhǎng)的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，增殖明顯的石斛芽莖生長(zhǎng)不明顯，反之，莖生長(zhǎng)較好的增殖率不高。所以研究不同問題時(shí)，要根據(jù)需要選擇適合的培養(yǎng)基，本研究認(rèn)為N6培養(yǎng)基最適合鐵皮石斛的增殖，而MS培養(yǎng)基較有利于莖的生長(zhǎng)。

3.2鐵皮石斛組培苗生長(zhǎng)的最適碳源

在比較不同碳源對(duì)鐵皮石斛生長(zhǎng)的影響中，試驗(yàn)結(jié)果表明，蔗糖對(duì)石斛芽的增殖效果最好，長(zhǎng)勢(shì)整齊健壯，對(duì)株高的影響優(yōu)于白糖和葡萄糖，這與魏梅娟等的研究結(jié)果[9]一致。從鐵皮石斛的生長(zhǎng)情況看，本研究還發(fā)現(xiàn)以白糖為碳源的叢生芽長(zhǎng)勢(shì)與以蔗糖為碳源的叢生芽長(zhǎng)勢(shì)相似，以葡萄為碳源的叢生芽長(zhǎng)勢(shì)最差，其莖較細(xì)，顏色淺綠。因此，本研究認(rèn)為大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)鐵皮石斛組培苗時(shí)，在盡量保證苗質(zhì)量的前提下，為了降低生產(chǎn)成本，以白糖作為碳源較合適。

3.3鐵皮石斛壯苗生根的最適附加物及濃度

天然有機(jī)物是植物組織培養(yǎng)中常用的添加物[10]，在長(zhǎng)期的組織培養(yǎng)實(shí)踐中，人們發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基內(nèi)加入某些適當(dāng)?shù)奶烊挥袡C(jī)添加物，能夠增強(qiáng)培養(yǎng)物的生長(zhǎng)、分化效應(yīng)，促進(jìn)培養(yǎng)物更好地存活、發(fā)育。植物組織培養(yǎng)中常用的天然有機(jī)添加物包括椰乳、香蕉汁、蘋果汁、番茄汁、胡蘿卜汁、馬鈴薯汁等[11]。本研究以香蕉汁和馬鈴薯汁為附加物，結(jié)果表明，香蕉汁和馬鈴薯汁對(duì)鐵皮石斛叢生芽增殖和壯苗生根培養(yǎng)具有不同的影響。從增殖效果來看，馬鈴薯汁處理更有利于叢生芽的增殖，并以25%馬鈴薯汁的增殖效果最佳，這將有利于短期快速獲得大量的試管苗；但馬鈴薯汁處理褐化現(xiàn)象較嚴(yán)重。增殖效果較差的是15%香蕉汁和20%香蕉汁。從根的

生長(zhǎng)情況來看，香蕉汁處理的生根率、根數(shù)、根長(zhǎng)都優(yōu)于馬鈴薯汁處理，在培養(yǎng)65 d時(shí)，3個(gè)香蕉汁處理的平均根長(zhǎng)都在 0.65 cm 以上，其中以添加25%香蕉汁處理的效果最好，其根長(zhǎng)達(dá)0.84 cm。從叢生芽的生長(zhǎng)情況來看，香蕉汁和馬鈴薯汁對(duì)鐵皮石斛叢生芽的生長(zhǎng)都有促進(jìn)作用，在培養(yǎng)65 d時(shí)各處理的平均株高達(dá)到1.86～2.1 cm，且香蕉汁處理的平均株高均稍大于馬鈴薯汁處理，其中25%香蕉汁處理的株高最大，為2.1 cm。綜合試驗(yàn)結(jié)果，本研究認(rèn)為，香蕉汁比馬鈴薯汁更有利于鐵皮石斛壯苗生根培養(yǎng)，且以25%香蕉汁處理效果最佳，這可能是香蕉汁和馬鈴薯汁所含的成分不同所致，有關(guān)這方面還需進(jìn)一步研究。

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