艾納香的組織培養

嚴敏+劉艷+湯洪敏

摘要：以貴州藥用植物艾納香的葉片為材料，MS培養基為基本培養基，探討影響艾納香組織培養的因素，為艾納香的組織培養快速繁殖提供重要的參考依據。結果表明：外植體滅菌組合以0.1%氯化汞8 min+75%乙醇5 s最佳；誘導愈傷組織培養基以MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L最佳，誘導率為88.17%；愈傷組織繼代培養基以MS+6-BA 3.0 mg/L+ NAA 0.1 mg/L最佳；愈傷組織分化為芽的培養基以MS+6-BA 3.0mg/L+ NAA 0.1mg/L最佳，以試管苗（由野外艾納香培育出的完整幼苗）葉片為外植體誘導愈傷組織，其分化率為93%；芽繼代培養基以MS+6-BA 3.0 mg/L+ NAA 0.1 mg/L最佳，平均苗高4.3 cm；IBA有利于艾納香的無根綠苗生根，以MS+IBA 1.4 mg/L 培養基培養，生根率為100%。

關鍵詞：艾納香；組織培養；愈傷組織；誘導；MS培養基

中圖分類號： Q943.1文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2014）02-0033-03

收稿日期：2013-07-12

基金項目：貴州省科技廳聯合課題（編號：黔科合J字LKM[2011]27、黔科合處G字[2011]7034號）。

作者簡介：嚴敏（1973—），貴州印江人，碩士，高級實驗師，研究方向為植物化學。E-mail：577977087@qq.com。

通信作者：湯洪敏。E-mail：thm@gznc.edu.cn。艾納香（Blumea balsamifera DC）為菊科艾納香屬植物，在我國僅分布在貴州、云南、廣東、廣西等少數濕熱地區[1]。艾納香葉提取的揮發油有特殊的清香，具有顯著的抗菌、消炎、消腫、止痛、止癢等作用[2]。艾納香油的主要成分為L-龍腦，主要用途之一是提制冰片（艾片），冰片具通竅、散熱、明目、止痛等功能。艾納香屬多年生宿根植物，主要以宿根分株繁殖，分生苗移栽成活率低；艾納香利用種子育苗，種子結實率低，休眠期長，發芽率低于5.8%[3]。這些情況導致艾納香種苗短缺，嚴重制約艾納香大規模生產，因此必須研究艾納香的組織培養以快速獲得批量種苗，擴大種植規模以滿足日益增長的市場要求。國內的報道主要著重在艾納香藥理研究上[4-5]，所以對艾納香進行植物組織培養是一條全面研究艾納香的重要途徑。通過本項目的實施，以期為貴州省艾納香成功培育試管苗作參考，同時也可為貴州省其他特色藥用植物的組織培養快繁提供參考。

1材料與方法

1.1供試材料

來源于貴州省羅甸縣，由貴州大學林學院熊中華副教授鑒定。

1.2培養基

MS培養基；以MS培養基為基本培養基，附加激素、白砂糖30 g/L、瓊脂13 g/L。所有培養基均在 1.1 kg/cm2、121 ℃的滅菌鍋中滅菌25 min。

1.3試驗方法

1.3.1艾納香外植體的滅菌處理將洗凈的外植體葉片用氯化汞和乙醇進行不同滅菌劑、不同時間的比較試驗及相同滅菌劑不同時間的比較試驗，以篩選出外植體滅菌的最佳處理。

1.3.2艾納香的接種

1.3.2.1誘導接種將已沖洗的外植體放入超凈臺中，并將其滅菌，然后把葉片剪成大小為0.6 cm×0.6 cm的小塊，接入誘導培養基中，每瓶接種8塊葉片。

1.3.2.2愈傷組織繼代接種將由外植體誘導出的愈傷組織接種于繼代培養基中。

1.3.2.3愈傷組織分化接種將愈傷組織接入分化培養基中，分化出芽。

1.3.2.4芽繼代培養接種將分化出的芽切分，轉入繼代培養基，每瓶接5株左右。

1.3.2.5生根壯苗接種將繼代培養出的具有3 cm左右的芽剪下來，接種在生根培養基中誘導生根。

1.3.3培養氣候條件誘導愈傷組織階段：將材料置于 25 ℃ 條件下培養，前5 d在黑暗條件下，之后每天接受自然光照。愈傷組織繼代、愈傷組織分化、芽繼代及生根壯苗階段：將材料置于25 ℃條件下培養，接受光照。

1.3.4NAA與6-BA對組織培養效果的影響以MS為基本培養基，探討不同濃度NAA與不同濃度6-BA組合對誘導愈傷組織、愈傷組織繼代培養、愈傷組織分化、芽繼代的效果的影響。

1.3.5生根壯苗試驗設計試驗材料為從艾納香葉片上誘導的芽。經查閱相關文獻可知，IBA 1.4 mg/L的生根效果較好[6]，所以生根培養基設計為MS+IBA 1.4 mg/L。

2結果與分析

2.1不同滅菌處理對艾納香外植體的滅菌效果

2.1.1單一滅菌劑的滅菌效果由表1、表2可知，單獨使用乙醇滅菌沒有效果，材料全部被污染。高濃度的氯化汞雖然能降低外植體的污染率，但是外植體褐化嚴重，難以誘導出愈傷組織。所以，單一滅菌劑對外植體的滅菌效果不佳。

2.1.2氯化汞和乙醇混合滅菌劑的滅菌效果從表3可知，最佳滅菌組合為0.1%氯化汞8 min+75%乙醇5 s。由于氯化汞對外植體的傷害大，難以誘導出愈傷組織，所以其濃度不宜增大，其作用時間也不宜延長。因為乙醇會使外植體褐化，影響外植體誘導成愈傷組織，甚至使外植體死亡，所以在能滅菌的情況下其作用時間越小越好。

2.2愈傷組織的誘導試驗結果與分析

2.2.1不同濃度NAA與相同濃度6-BA組合對愈傷組織誘導的效果由表4可知，NAA 0.1 mg/L+6-BA 3.0 mg/L培養基最適合艾納香誘導愈傷組織。

2.2.2不同濃度6-BA和與相同濃度NAA組合對愈傷組織誘導的效果由表5可知，6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L 培養基最適合艾納香誘導愈傷組織。

2.3愈傷組織的繼代培養試驗結果與分析

2.3.1不同濃度NAA和與相同濃度6-BA配組對愈傷組織繼代培養的影響由表6可知，NAA 0.1 mg/L+6-BA 3.0 mg/L 處理的愈傷組織增殖倍數最高，為298倍，其褐化率也相對最低，所以NAA 0.1 mg/L+6-BA 3.0 mg/L為最佳繼代培養基。

2.3.2不同濃度6-BA和與相同濃度NAA配組對愈傷組織繼代培養的影響由表7可知，6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L 處理的愈傷組織增殖倍數最高，為3.2倍，為最適宜愈傷組織繼代培養的激素濃度

2.4愈傷組織的分化培養結果與分析

2.4.1不同濃度NAA和與相同濃度6-BA配組對愈傷組織分化的影響由表8可看出，隨著NAA濃度的提高，芽分化率呈先上升后下降的趨勢，褐化率隨之升高，只有在NAA 0.1 mg/L+6-BA 3.0 mg/L條件下，芽分化率最高，為4%。所以，只有添加適宜濃度的NAA，才能使芽分化率最大。

2.4.2不同濃度6-BA和與相同濃度NAA配組對愈傷組織分化的影響由表9可看出，隨著6-BA濃度的提高，芽分化率呈上升的趨勢，褐化率先降低后升高，只有在6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L處理時，芽分化率最高為4%。所以，只有添加適宜濃度的 6-BA，才能使芽分化率達到最大。

2.5芽繼代培養試驗結果與分析

2.5.1不同濃度NAA和與相同濃度6-BA配組對芽繼代的影響由表10可知，芽在繼代培養過程中，芽的增殖倍數差異不大；其平均苗高呈先升后降再升的趨勢。

2.5.2不同濃度6-BA和與相同濃度NAA配組對芽繼代培養的影響由表11可知，不同濃度的激素組合對芽繼代培養的情況不同，以MS+NAA 0.1 mg/L+6-BA 3.0 mg/L組合為最佳組合，平均苗高4.3 cm。

2.6生根壯苗的試驗結果與分析

經過生根培養基MS+IBA 1.4 mg/L 培養出來的幼苗，1個月后生根率為100%，平均根長為4.3 cm，平均苗高為 7.4 cm。圖1為生根培養基MS+IBA 1.4 mg/L培養出來的幼苗。

3結論

本試驗以艾納香葉片為材料，篩選出最佳滅菌劑組合及滅菌時間、誘導愈傷組織的最佳培養基配方、愈傷組織繼代培養的最佳培養基配方、愈傷組織分化的最佳培養基配方、芽繼代的最佳培養基配方、生根壯苗的培養基配方。從外植體的滅菌到成為一株完整幼苗的過程中每一步都很重要，缺了任何一個步驟本試驗都無法成功。本試驗結果表明，對外植體進行滅菌的最佳組合為0.1%氯化汞 8 min+75%乙醇 5 s；單獨使用氯化汞或者乙醇對艾納香滅菌效果不好。不同濃度的激素組合對艾納香葉片誘導愈傷組織情況不同，以MS+ 6-BA 30 mg/L+NAA 0.1 mg/L組合為最佳組合，誘導率為8817%；不同濃度的激素組合對愈傷組織繼代培養的情況不同，以MS+6-BA 3.0 mg/L + NAA 0.1 mg/L組合為最佳組合；不同濃度的激素組合處理的艾納香葉片愈傷組織分化為芽的情況不同，以MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L 組合為最佳組合，以野外艾納香葉片為外植體誘導出的愈傷組織分化率為4%；以試管苗（由野外艾納香培育出的完整幼苗）葉片為外植體誘導出的愈傷組織分化率為93%；不同濃度的激素組合處理的葉片的芽繼代培養情況不同，以MS+ 6-BA 3.0 mg/L + NAA 0.1 mg/L 組合為最佳組合，平均苗高4.3 cm。IBA有利于艾納香的無根綠苗生根，以MS+IBA 1.4 mg/L 培養基培養的生根率為100%。

參考文獻：

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[5]許實波，趙金華. 艾鈉香二氫黃酮對大鼠實驗性肝損傷的保護作用[J]. 中國藥理學通報，1998，14（2）：191-192.

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2.3愈傷組織的繼代培養試驗結果與分析

2.3.1不同濃度NAA和與相同濃度6-BA配組對愈傷組織繼代培養的影響由表6可知，NAA 0.1 mg/L+6-BA 3.0 mg/L 處理的愈傷組織增殖倍數最高，為298倍，其褐化率也相對最低，所以NAA 0.1 mg/L+6-BA 3.0 mg/L為最佳繼代培養基。

2.3.2不同濃度6-BA和與相同濃度NAA配組對愈傷組織繼代培養的影響由表7可知，6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L 處理的愈傷組織增殖倍數最高，為3.2倍，為最適宜愈傷組織繼代培養的激素濃度

2.4愈傷組織的分化培養結果與分析

2.4.1不同濃度NAA和與相同濃度6-BA配組對愈傷組織分化的影響由表8可看出，隨著NAA濃度的提高，芽分化率呈先上升后下降的趨勢，褐化率隨之升高，只有在NAA 0.1 mg/L+6-BA 3.0 mg/L條件下，芽分化率最高，為4%。所以，只有添加適宜濃度的NAA，才能使芽分化率最大。

2.4.2不同濃度6-BA和與相同濃度NAA配組對愈傷組織分化的影響由表9可看出，隨著6-BA濃度的提高，芽分化率呈上升的趨勢，褐化率先降低后升高，只有在6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L處理時，芽分化率最高為4%。所以，只有添加適宜濃度的 6-BA，才能使芽分化率達到最大。

2.5芽繼代培養試驗結果與分析

2.5.1不同濃度NAA和與相同濃度6-BA配組對芽繼代的影響由表10可知，芽在繼代培養過程中，芽的增殖倍數差異不大；其平均苗高呈先升后降再升的趨勢。

2.5.2不同濃度6-BA和與相同濃度NAA配組對芽繼代培養的影響由表11可知，不同濃度的激素組合對芽繼代培養的情況不同，以MS+NAA 0.1 mg/L+6-BA 3.0 mg/L組合為最佳組合，平均苗高4.3 cm。

2.6生根壯苗的試驗結果與分析

經過生根培養基MS+IBA 1.4 mg/L 培養出來的幼苗，1個月后生根率為100%，平均根長為4.3 cm，平均苗高為 7.4 cm。圖1為生根培養基MS+IBA 1.4 mg/L培養出來的幼苗。

3結論

本試驗以艾納香葉片為材料，篩選出最佳滅菌劑組合及滅菌時間、誘導愈傷組織的最佳培養基配方、愈傷組織繼代培養的最佳培養基配方、愈傷組織分化的最佳培養基配方、芽繼代的最佳培養基配方、生根壯苗的培養基配方。從外植體的滅菌到成為一株完整幼苗的過程中每一步都很重要，缺了任何一個步驟本試驗都無法成功。本試驗結果表明，對外植體進行滅菌的最佳組合為0.1%氯化汞 8 min+75%乙醇 5 s；單獨使用氯化汞或者乙醇對艾納香滅菌效果不好。不同濃度的激素組合對艾納香葉片誘導愈傷組織情況不同，以MS+ 6-BA 30 mg/L+NAA 0.1 mg/L組合為最佳組合，誘導率為8817%；不同濃度的激素組合對愈傷組織繼代培養的情況不同，以MS+6-BA 3.0 mg/L + NAA 0.1 mg/L組合為最佳組合；不同濃度的激素組合處理的艾納香葉片愈傷組織分化為芽的情況不同，以MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L 組合為最佳組合，以野外艾納香葉片為外植體誘導出的愈傷組織分化率為4%；以試管苗（由野外艾納香培育出的完整幼苗）葉片為外植體誘導出的愈傷組織分化率為93%；不同濃度的激素組合處理的葉片的芽繼代培養情況不同，以MS+ 6-BA 3.0 mg/L + NAA 0.1 mg/L 組合為最佳組合，平均苗高4.3 cm。IBA有利于艾納香的無根綠苗生根，以MS+IBA 1.4 mg/L 培養基培養的生根率為100%。

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2.3愈傷組織的繼代培養試驗結果與分析

2.3.1不同濃度NAA和與相同濃度6-BA配組對愈傷組織繼代培養的影響由表6可知，NAA 0.1 mg/L+6-BA 3.0 mg/L 處理的愈傷組織增殖倍數最高，為298倍，其褐化率也相對最低，所以NAA 0.1 mg/L+6-BA 3.0 mg/L為最佳繼代培養基。

2.3.2不同濃度6-BA和與相同濃度NAA配組對愈傷組織繼代培養的影響由表7可知，6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L 處理的愈傷組織增殖倍數最高，為3.2倍，為最適宜愈傷組織繼代培養的激素濃度

2.4愈傷組織的分化培養結果與分析

2.4.1不同濃度NAA和與相同濃度6-BA配組對愈傷組織分化的影響由表8可看出，隨著NAA濃度的提高，芽分化率呈先上升后下降的趨勢，褐化率隨之升高，只有在NAA 0.1 mg/L+6-BA 3.0 mg/L條件下，芽分化率最高，為4%。所以，只有添加適宜濃度的NAA，才能使芽分化率最大。

2.4.2不同濃度6-BA和與相同濃度NAA配組對愈傷組織分化的影響由表9可看出，隨著6-BA濃度的提高，芽分化率呈上升的趨勢，褐化率先降低后升高，只有在6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L處理時，芽分化率最高為4%。所以，只有添加適宜濃度的 6-BA，才能使芽分化率達到最大。

2.5芽繼代培養試驗結果與分析

2.5.1不同濃度NAA和與相同濃度6-BA配組對芽繼代的影響由表10可知，芽在繼代培養過程中，芽的增殖倍數差異不大；其平均苗高呈先升后降再升的趨勢。

2.5.2不同濃度6-BA和與相同濃度NAA配組對芽繼代培養的影響由表11可知，不同濃度的激素組合對芽繼代培養的情況不同，以MS+NAA 0.1 mg/L+6-BA 3.0 mg/L組合為最佳組合，平均苗高4.3 cm。

2.6生根壯苗的試驗結果與分析

經過生根培養基MS+IBA 1.4 mg/L 培養出來的幼苗，1個月后生根率為100%，平均根長為4.3 cm，平均苗高為 7.4 cm。圖1為生根培養基MS+IBA 1.4 mg/L培養出來的幼苗。

3結論

本試驗以艾納香葉片為材料，篩選出最佳滅菌劑組合及滅菌時間、誘導愈傷組織的最佳培養基配方、愈傷組織繼代培養的最佳培養基配方、愈傷組織分化的最佳培養基配方、芽繼代的最佳培養基配方、生根壯苗的培養基配方。從外植體的滅菌到成為一株完整幼苗的過程中每一步都很重要，缺了任何一個步驟本試驗都無法成功。本試驗結果表明，對外植體進行滅菌的最佳組合為0.1%氯化汞 8 min+75%乙醇 5 s；單獨使用氯化汞或者乙醇對艾納香滅菌效果不好。不同濃度的激素組合對艾納香葉片誘導愈傷組織情況不同，以MS+ 6-BA 30 mg/L+NAA 0.1 mg/L組合為最佳組合，誘導率為8817%；不同濃度的激素組合對愈傷組織繼代培養的情況不同，以MS+6-BA 3.0 mg/L + NAA 0.1 mg/L組合為最佳組合；不同濃度的激素組合處理的艾納香葉片愈傷組織分化為芽的情況不同，以MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L 組合為最佳組合，以野外艾納香葉片為外植體誘導出的愈傷組織分化率為4%；以試管苗（由野外艾納香培育出的完整幼苗）葉片為外植體誘導出的愈傷組織分化率為93%；不同濃度的激素組合處理的葉片的芽繼代培養情況不同，以MS+ 6-BA 3.0 mg/L + NAA 0.1 mg/L 組合為最佳組合，平均苗高4.3 cm。IBA有利于艾納香的無根綠苗生根，以MS+IBA 1.4 mg/L 培養基培養的生根率為100%。

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