依達(dá)拉奉對(duì)實(shí)驗(yàn)性小鼠自身免疫性腦脊髓炎的抑制作用

鄭慧敏，劉世軍，孫克明，劉憲勇, 郭俊青

依達(dá)拉奉對(duì)實(shí)驗(yàn)性小鼠自身免疫性腦脊髓炎的抑制作用

鄭慧敏1，劉世軍1，孫克明1，劉憲勇1, 郭俊青2

目的研究依達(dá)拉奉對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE)小鼠的抑制作用。方法將60只雌性C57BL/6小鼠隨機(jī)分為3組：正常對(duì)照組、EAE組、EAE+依達(dá)拉奉組，每組20只。正常對(duì)照組用PBS作為對(duì)照。后兩組應(yīng)用髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白35-55、完全福氏佐劑(CFA)、結(jié)核分枝桿菌，制成的抗原乳劑進(jìn)行造模。免疫2 d后，EAE+依達(dá)拉奉組腹腔注射依達(dá)拉奉5 mg/(kg·d)。3組均監(jiān)測(cè)20 d，每日稱重，觀察小鼠的攝食和發(fā)病情況，并進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分。20 d后取小鼠脊髓組織，進(jìn)行病理學(xué)觀察。結(jié)果EAE組小鼠的發(fā)病率(80%)高于EAE+依達(dá)拉奉組(45%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。EAE+依達(dá)拉奉組神經(jīng)功能評(píng)分各個(gè)時(shí)間點(diǎn)都低于EAE組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中，監(jiān)測(cè)10 d后，EAE組神經(jīng)功能評(píng)分(3.6±0.4)級(jí)；而EAE+依達(dá)拉奉組評(píng)分為(1.3±0.5)級(jí)。HE染色后發(fā)現(xiàn)，EAE組小鼠的脊髓內(nèi)有大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，白質(zhì)脫髓鞘改變明顯。而EAE+依達(dá)拉奉組小鼠有較少的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，且沒有白質(zhì)脫髓鞘改變。結(jié)論依達(dá)拉奉對(duì)EAE的保護(hù)作用可能與其清除自由基、減輕炎性反應(yīng)有關(guān)。

依達(dá)拉奉；實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎；多發(fā)性硬化

多發(fā)性硬化(multiple sclerosis, MS)是發(fā)生在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的自身免疫性脫髓鞘疾病，多次反復(fù)發(fā)作或病程進(jìn)展迅速可導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)障礙，最終全身癱瘓[1]。該病病因和發(fā)病機(jī)制尚不明確，近年來越來越多的研究表明，自由基損傷可能與MS的發(fā)病密切相關(guān)[2]。依達(dá)拉奉是一種新型的自由基清除劑，一方面具有直接清除自由基、減輕血腦屏障破壞等作用；另一方面能通過抑制次黃、黃嘌呤氧化酶的活性，減少炎性介質(zhì)白三烯等的生成，并抑制遲發(fā)性神經(jīng)元死亡[3]。本研究通過建立實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE)模型，給予依達(dá)拉奉注射液進(jìn)行干預(yù)，觀察小鼠的發(fā)病率、神經(jīng)功能損傷情況及病理學(xué)改變，探討依達(dá)拉奉對(duì)EAE小鼠的抑制作用，為臨床治療干預(yù)MS提供新思路、新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 抗原及藥物 免疫抗原MOG35-55(MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK)由美聯(lián)(西安)生物科技有限公司合成，經(jīng)質(zhì)譜及HPLC色譜分析，純度>95%，完全福式佐劑(CFA, Sigma)與百日咳毒素(PT)均購(gòu)自上海生物制品研究所。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雌性C57BL/6小鼠60只，4～6周齡，體重11～15 g。清潔級(jí)，以標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，飲用自來水，環(huán)境恒溫20～25 ℃。購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。合格證號(hào)：SCXK(滬)2007000532247。

1.2 方法

1.2.1 分組及EAE模型的建立 60只小鼠隨機(jī)分為：正常對(duì)照組、EAE組和EAE+依達(dá)拉奉組3組，每組20只。用0.01 mol/L的磷酸緩沖液(phosphate buffer solution，PBS)將MOG35-55稀釋成300 μg/ml，再用完全福氏佐劑(CFA)將結(jié)核分枝桿菌稀釋成4 mg/ml。用注射器抽打至油包水狀態(tài)，制成誘導(dǎo)EAE的抗原乳劑。正常對(duì)照組用PBS作為對(duì)照，EAE組、EAE+依達(dá)拉奉組小鼠分別腹股溝皮下注射相應(yīng)抗原，100 μl/只，記免疫當(dāng)天為0 d，于0、2 d給予小鼠腹腔注射百日咳毒素200 μl/只。免疫后2 d，給予EAE+依達(dá)拉奉組小鼠腹腔注射依達(dá)拉奉5 mg/(kg·d)，1次/d，連續(xù)給予20 d。

1.2.2 體質(zhì)量監(jiān)測(cè)及神經(jīng)功能評(píng)分 免疫當(dāng)天開始，每日稱重，觀察小鼠的攝食和發(fā)病情況，并進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分，連續(xù)觀察20 d。神經(jīng)功能評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為通用的0～5級(jí)評(píng)分法：0級(jí)，不發(fā)??；1級(jí)，小鼠尾部張力降低或麻痹；2級(jí)，小鼠尾部麻痹，后肢無力；3級(jí)，小鼠后肢癱瘓；4級(jí)，小鼠四肢癱瘓，人為翻身不能復(fù)位；5級(jí)，瀕死狀態(tài)或發(fā)病后死亡[1]。

1.2.3 組織取材與病理學(xué)檢查 自免疫后20 d，腹腔注射2%的戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉各組所有小鼠，在無菌條件下剖開胸腔，暴露心臟，經(jīng)左心室灌注PBS至肝臟變白，然后改用4%多聚甲醛灌注固定，隨后立即取出腦和脊髓浸入甲醛中固定。常規(guī)石蠟包埋后制成5 μm厚的切片，HE染色，并在光鏡下觀察炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及脫髓鞘改變[1]。

2 結(jié) 果

2.1 發(fā)病率及臨床表現(xiàn) 正常對(duì)照組無一只發(fā)病。EAE組發(fā)病 16 只，發(fā)病率80%；EAE+依達(dá)拉奉組發(fā)病9只，發(fā)病率 45%；兩組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.023)。后兩組發(fā)病開始于免疫后8 d，約在10 d達(dá)到發(fā)病高峰。主要表現(xiàn)為食欲下降、體重減輕。同時(shí)，EAE組小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)受損癥狀明顯，表現(xiàn)為尾部無力拖垂，步履蹣跚，后肢癱瘓，行動(dòng)困難，病情進(jìn)一步發(fā)展表現(xiàn)為四肢癱瘓。

2.2 神經(jīng)功能評(píng)分 免疫后20 d內(nèi)EAE組和EAE+依達(dá)拉奉組神經(jīng)功能評(píng)分見表1，兩組均在免疫后8 d評(píng)分開始增高，并隨著免疫時(shí)間的延長(zhǎng)，評(píng)分逐漸升高，16 d后，評(píng)分開始下降。與EAE組比較，EAE+依達(dá)拉奉組在不同時(shí)間的評(píng)分均低，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。EAE組小鼠最高神經(jīng)功能評(píng)分為4級(jí)，10 d時(shí)評(píng)分為(3.6±0.4)級(jí)；EAE+依達(dá)拉奉組最高為3級(jí)，10 d時(shí)評(píng)分為(1.3±0.5)級(jí)。

表1 免疫后兩組小鼠的神經(jīng)功能評(píng)分 ±s；級(jí))

注：4、6 d的評(píng)分兩組均為0

2.3 病理學(xué)檢查 正常對(duì)照組小鼠脊髓未見明顯異常。EAE組小鼠脊髓的實(shí)質(zhì)中有大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，以淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞為主，病變主要集中在脊髓腰膨大的白質(zhì)區(qū)，在白質(zhì)區(qū)可見大小不等的髓鞘脫失區(qū)，而且髓鞘脫失區(qū)程度與EAE小鼠的臨床癥狀的嚴(yán)重程度直接相關(guān)。而EAE+依達(dá)拉奉組小鼠脊髓的實(shí)質(zhì)中僅有少量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，且沒有髓鞘脫失。結(jié)果見圖1。

圖1 小鼠脊髓組織的病理檢查結(jié)果(HE)

3 討 論

MS是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘疾病，以青、中年多見，臨床特點(diǎn)是病灶播散廣泛，病程中常有緩解復(fù)發(fā)的神經(jīng)系統(tǒng)損害癥狀，目前尚無特殊治療方法，且往往預(yù)后不佳。EAE小鼠模型是公認(rèn)的MS動(dòng)物模型[4]，本研究中，EAE組小鼠自免疫后8 d開始發(fā)病，約在20 d達(dá)到發(fā)病高峰，最高神經(jīng)功能評(píng)分為4級(jí)。

依達(dá)拉奉是一種腦保護(hù)藥(自由基清除劑)，大量研究證實(shí)其對(duì)缺血?jiǎng)游飳?shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ陀星宄杂苫?、抗腦水腫、縮小梗死體積及改善神經(jīng)功能等保護(hù)作用[5-9]。作為新型自由基清除劑、抗氧劑，已廣泛應(yīng)用于急性腦梗死的治療中。文獻(xiàn)[10]提示，依達(dá)拉奉可清除自由基，抑制脂質(zhì)過氧化，從而抑制腦細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞的氧化損傷。

本研究中，EAE組的神經(jīng)功能缺損程度最嚴(yán)重，細(xì)胞形態(tài)學(xué)顯示脊髓組織多可見大量炎性病灶，以淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞為主。在使用依達(dá)拉奉干預(yù)后，神經(jīng)功能缺損程度減輕，血管周圍炎性浸潤(rùn)細(xì)胞數(shù)減少，且細(xì)胞學(xué)形態(tài)改善更明顯，結(jié)果顯示依達(dá)拉奉對(duì)EAE具有神經(jīng)保護(hù)作用。經(jīng)依達(dá)拉奉干預(yù)后，EAE+依達(dá)拉奉組小鼠的發(fā)病率為45%，明顯低于EAE組。

本研究結(jié)果表明，依達(dá)拉奉能減輕EAE病情嚴(yán)重程度，改善病變區(qū)域病理形態(tài)學(xué)表現(xiàn)，對(duì)EAE具有保護(hù)作用，其保護(hù)作用可能與其清除自由基、減輕炎性反應(yīng)有關(guān)。本研究對(duì)依達(dá)拉奉治療MS 提供了新的思路。

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(2014-02-05收稿 2014-04-10修回)

(責(zé)任編輯 武建虎)

Inhibitingeffectofedaravoneonexperimentalautoimmuneencephalomyelitisinmice

ZHENG Huimin1, LIU Shijun1, SUN Keming1, LIU Xianyong1，and GUO Junqing2. 1. Department of Pharmacy, Shandong Provincial Corps Hospital, Chinese People’s Armed Police Forces, Jinan 250014, China；2. Outpatient Department of Shandong Provincial Corps, Chinese People’s Armed Police Forces, Jinan 250014, China

ObjectiveTo study the inhibiting effect of edaravone on experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) mouse model.MethodsSixty female C57BL / 6 mice were randomly divided into three groups: normal control group, EAE group, EAE + edaravone group (n=20), normal control group with PBS as a control. The application of myelin oligodendrocytes glial cells glycoprotein 35-55 and complete Freund’s adjuvant (CFA) and Mycobacterium tuberculosis antigens emulsions were made modeling in the later two groups. After 2 days immunization, EAE+edaravone group were injected at a dose of 5 mg/(kg·d) of edaravone. Three groups were monitored 20 days, daily weighing, feeding and incidence were observed, and neurological function was scored. Mouse spinal cord tissue was obtained for pathological examination after 20 days.ResultsIn EAE+edaravone treated mice, compared with EAE mice, the incidence and neurological function scores were significantly low (P<0.05). The incidence in EAE group was 80%, while the incidence in EAE+ edaravone group mice was 45%. Monitored for 10 days, in EAE group mice, neural function score was 3.6±0.4, while in EAE+ edaravone group mice neural function score was 1.3±0.5. HE staining found a large number of inflammatory cell infiltration in EAE mice spinal cord, and white matter demyelination was obvious. Nevertheless edaravone group mice had fewer inflammatory cell infiltration, and no white matter demyelination.ConclusionsProtective effect of edaravone on EAE is related to scavenging free radicals and reducing inflammation.

edaravone; experimental autoimmune encephalomyelitis; multiple sclerosis

鄭慧敏，碩士，主管藥師，E-mail: zhm1216@126.com

1.250014濟(jì)南，武警山東總隊(duì)醫(yī)院藥劑科；2.250014濟(jì)南，武警山東總隊(duì)機(jī)關(guān)門診部

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