肝移植并FK506聯(lián)合用藥后人血清蛋白質(zhì)組的二維凝膠電泳分析

李 彥，王鴻麗， 趙永強，劉 煜，梁 艷

肝移植并FK506聯(lián)合用藥后人血清蛋白質(zhì)組的二維凝膠電泳分析

李 彥1，王鴻麗2， 趙永強2，劉 煜3，梁 艷1

目的探索肝臟移植并FK506聯(lián)合用藥后人血清中蛋白質(zhì)組的變化，研究免疫排斥反應(yīng)的機制及FK506聯(lián)合用藥的作用。方法取5例肝癌患者移植前和移植后24 h、10 d、30 d、90 d、180 d的血清樣品，用Aurum Serum Protein Mini Kit除高峰度蛋白，進(jìn)行雙向電泳(2-DE)分離，ImageMaster 2D Platinum圖像分析軟件分析電泳圖譜。結(jié)果建立移植前和移植后并FK506聯(lián)合用藥的人血清雙向電泳差異圖譜，蛋白斑點數(shù)在(877±59)～(897±61)，移植前、后不同組之間的匹配均>70%。共篩選出重復(fù)性好且表達(dá)顯著差異的蛋白質(zhì)斑點7個。結(jié)論初步建立了肝移植并FK506聯(lián)合用藥后人血清蛋白質(zhì)組的2-DE分析方法。

肝移植；免疫排斥；免疫抑制藥；FK506；血清；雙向電泳

普樂可復(fù)(tacrolimus, FK506) 是大環(huán)內(nèi)酯類免疫抑制藥[1]，目前已成為臨床抗排斥反應(yīng)的首選藥物，用于肝臟或腎臟移植術(shù)后其他免疫抑制藥物無法控制的移植物排斥反應(yīng)[2,3]，其體內(nèi)作用機制還在深入研究中。免疫抑制藥驍悉可改善肝移植術(shù)后服用FK506造成的腎損傷，常和激素一起與FK506聯(lián)合用藥[4,5]。由于蛋白質(zhì)不僅是多種致病因子對機體作用最重要的靶分子，而且也是大多數(shù)藥物的靶標(biāo)，應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)等生物技術(shù)在發(fā)現(xiàn)新的藥物靶標(biāo)、論證藥理作用及不良反應(yīng)等方面已發(fā)揮了有效作用[6,7]。筆者采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)中的雙向凝膠電泳(2-DE)技術(shù)，通過比較移植前和移植后蛋白質(zhì)組的電泳圖譜差異，尋找表達(dá)差異蛋白質(zhì)，旨在從蛋白質(zhì)組學(xué)角度探索肝移植后的免疫排斥機制，以及FK506聯(lián)合用藥的作用機制，為合理選擇和使用免疫抑制藥，以及探索免疫抑制藥治療方案提供線索。

1 材料與方法

1.1 樣品來源 取5例武警總醫(yī)院肝移植研究所肝癌移植患者(年齡27～65歲)移植前和移植后24 h、10 d、30 d、90 d、180 d的血清樣品，共6組30個樣品。移植后采用三聯(lián)用藥: FK506+驍悉+激素，3個月時停用激素，3個月內(nèi)FK506濃度為8～10 ng/ml，3～6個月為6～8 ng/ml。

1.2 試劑 血清樣品處理試劑盒(Aurum Serum Protein Mini Kit)購自BIO-RAD公司，3000 MW超濾管購自Sartorius公司，IPG膠條(ImmobilineTM DryStrip，pH3-10，NL,18cm)、IEF buffer ( pH3～10，NL)。CHAPS、十二烷基硫酸鈉(SDS)、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、三羥甲基氨基甲烷(Tris)購自GE公司。硝酸銀、二硫蘇糖醇(DTT)、碘乙酰胺等購自Sigma公司。

1.3 設(shè)備 PROTEAN等電聚焦電泳儀、垂直板電泳儀(PROTEAN Ⅱxi Cell)購自Bio-Rad公司。ImageMaster 2D platinum圖像分析軟件購自Amersham Pharmacia公司。UV160紫外分光光度計購自日本SHIMADSU公司，MIKRO 22R冷凍離心機購自德國Hettich公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 樣品制備 血清中高豐度白蛋白和IgG的去除按照Aurum Serum Protein Mini Kit的操作方法，處理后的血清用3000 MW超濾管4 ℃、8000 r/min離心40 min，取上清。按Bradford法進(jìn)行蛋白定量[8]。

1.4.2 雙向電泳

1.4.2.1 第一向等電點聚焦 分別取180 μg處理后的血清，加入重泡脹液(8 M Urea、8%CHAPS、0.5% IEF buffer、微量溴酚藍(lán))至總體積350 μl，震蕩混勻，均勻加入IEF聚焦槽中，膠條膠面朝下貼在混合液上，用礦物油覆蓋膠條。聚焦參數(shù)：水化1 h；30 V 10 h；500 V 30 min；1000 V 30 min；2000 V 30 min；5000 V 30 min；8000 V 30 min；10 000 V至80 000 VHrs。

1.4.2.2 平衡 聚焦后的IPG膠條在含20 mM的DTT和碘乙酰胺平衡液(50 mM, 1.5 M Tris-Cl,pH8.8、6 M Urea、30%Glycerol、20%SDS、微量溴酚藍(lán))中分別平衡15 min。

1.4.2.3 第二向SDS-PAGE電泳及染色 用13%(T為13%，C為2. 6%)的SDS-PAGE凝膠分離，恒流20 mA/膠，40 min，30 mA/膠至溴酚藍(lán)前沿至凝膠底部。應(yīng)用硝酸銀染色法染色[9]。

1.4.3 凝膠分析 應(yīng)用Labscan掃描軟件獲取圖像，用圖像分析軟件對2D凝膠圖像進(jìn)行點檢測、校準(zhǔn)、定量蛋白質(zhì)點、匹配、比較等分析。差異蛋白質(zhì)點的篩選使用圖像分析軟件和人工驗證的方法，對比移植前后所有分離蛋白質(zhì)斑點的%Vol值(包含在n個蛋白質(zhì)點的一張凝膠中，蛋白質(zhì)點X在所有點體積之和中所占的相對體積)。

2 結(jié) 果

獲得免疫抑制藥FK506+驍悉+激素聯(lián)合用藥在肝移植后人血清蛋白質(zhì)的雙向電泳差異表達(dá)譜(圖1)。肝移植前后樣本的生物學(xué)重復(fù)性為3次，由圖像分析軟件分析各電泳圖譜，得到肝移植前和肝移植后24 h、10 d、30 d、90 d、180 d圖譜的蛋白斑點數(shù)分別為(898±23)、(934±43)、(919±62)、(877±59)、(976±61)和(932±45)個，肝移植前和肝移植后的平均匹配率>70%以上。共篩選出表達(dá)量差異>2倍且在不同患者之間重復(fù)性好的蛋白質(zhì)斑點7個(表1)。其中蛋白質(zhì)斑點624移植后蛋白斑點顯著上調(diào)(>3倍)且在移植后的不同階段表達(dá)穩(wěn)定；蛋白點785的表達(dá)量在移植前和移植后的不同時間段呈現(xiàn)逐漸上調(diào)變化；斑點793在移植后24 h表達(dá)量明顯升高，且在隨后的時間段表達(dá)量保持穩(wěn)定；斑點576在移植后24 h后表達(dá)下調(diào)，在移植10 d后的不同階段呈現(xiàn)出持續(xù)上調(diào)的變化。

表1 肝移植前后FK506聯(lián)合用藥的人血清顯著蛋白差異表達(dá) (%Vol)

圖1 FK506聯(lián)合用藥在肝移植后人血清雙向電泳的差異表達(dá)圖譜

3 討 論

近些年，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在發(fā)現(xiàn)藥物靶點、闡明藥物作用機制等方面的研究中發(fā)揮了極大的作用[10,11]，但還未有免疫抑制藥在人肝移植后抗排斥作用的蛋白質(zhì)組學(xué)方面的報道。本研究將5例乙型肝炎肝硬化、肝癌移植前和移植后服用免疫抑制藥FK506+驍悉+激素聯(lián)合用藥不同時間段的血清樣品進(jìn)行比較。樣品采用BIO-RAD公司Aurum Serum Protein Mini Kit試劑盒特異性吸附白蛋白和IgG，用分子量3000 ku超濾管進(jìn)行除鹽和濃縮。經(jīng)處理后樣品的凝膠圖譜蛋白質(zhì)斑點數(shù)顯著提高。初步建立了肝移植前和肝移植并FK506聯(lián)合用藥后24 h、10 d、30 d、90 d、180 d的2-DE差異表達(dá)圖譜。筆者將進(jìn)一步利用質(zhì)譜技術(shù)鑒定差異蛋白質(zhì)，以期從蛋白質(zhì)組學(xué)角度深入探索肝移植后FK506+驍悉+激素聯(lián)合用藥的作用機制， 為進(jìn)一步開展肝臟移植和藥物治療奠定基礎(chǔ)。

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(2014-02-18收稿 2014-05-06修回)

(責(zé)任編輯 尤偉杰)

Two-dimensionalgelelectrophoresisanalysisofhumanserumproteomeafterlivertransplantationandFK506combinationtherapy

LI Yan1,WANG Hongli2,ZHAO Yongqiang2，Liu Yu3,and LIANG Yan1.1. Department of Pharmacy, 3. Institute of Liver Transplantation, General Hospital of Chinese People’s Armed Police Forces, Beijing 100039, China;2. National Center of Biomedical Analysis,Beijing 100850, China

ObjectiveTo analyze the serum proteome change after liver transplantation and FK506 combination in human serum by two-dimensional gel electrophoresis (2-DE) and to study the mechanism of immune rejection and the mechanism of action of FK506 combination.MethodsThe serum samples of 5 liver transplantation patients pre- and post transplantation at 24 hours,10 days,30 days,90 days 180 days were treated using Aurum Serum Protein Mini Kit, and than analyzed by 2-DE. The electrophoresis images were analyzed by using ImageMaster 2D platirum imaging analysis software.ResultsThe differential maps of 2-DE of serum proteome before and after liver transplantation and FK506 combination were established. Protein spots between (877±59.65)-(897.6±61.01),the matching rate before transplantation and different groups after transplantation>70%. Among them 7 protein spots were selected with good repeatability and significant differential expression.ConclusionsThe 2-DE analytical method of serum proteome after liver transplantation and FK506 combination was preliminarily established. The differential expression protein spots found in the study have laid a foundation for the further study .

liver transplantation; immune rejection; immunosuppressant; FK506; serum; 2-DE

武警總醫(yī)院二類課題(WZ2011019)

李 彥，本科學(xué)歷，副主任藥師，E-mail：lyanbjing@126.com

100039北京，武警總醫(yī)院：1.藥劑科，3.肝臟移植研究所；2.100850北京，國家生物醫(yī)學(xué)分析中心

梁 艷，E-mail：ly.w.j@163.com

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