高效液相色譜法測(cè)定骨刺丸中歐前胡素含量

李學(xué)紅，鞏長(zhǎng)芹，周利章

（山東省臨沂市藥品檢驗(yàn)所，山東 臨沂 276001）

骨刺丸[1]由制川烏、制草烏、制天南星、秦艽、白芷、當(dāng)歸、甘草、紅花等12味藥組方，具有祛風(fēng)止痛的功效，用于骨質(zhì)增生、風(fēng)濕類(lèi)關(guān)節(jié)炎、風(fēng)濕痛。其中白芷為方中主藥，歐前胡素為其主要有效成分。為進(jìn)一步提高了該藥質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，筆者采用高效液相色譜法測(cè)定骨刺丸中歐前胡素的含量，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

Agilent 1260型高效液相色譜儀，包括四元泵、在線脫氣機(jī)、柱溫箱、自動(dòng)進(jìn)樣器、G1315D 1260DAD VL檢測(cè)器（美國(guó)Agilent公司）；XS205DU型電子分析天平（梅特勒 －托利多公司）；KQ3200型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。歐前胡素對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，供含量測(cè)定用，批號(hào)為110826－201013，含量以 99．6%計(jì)）；骨刺丸（水蜜丸，河北萬(wàn)歲藥業(yè)有限公司，批號(hào)分別為 111105，120203，120601）；甲醇為色譜純，水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2．1 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：AgilentC18柱（250 mm×4．6mm，5 μm）以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動(dòng)相：甲醇 －水（60 ∶40）；流速：1．0 mL ／min；柱溫：35℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：300 nm。理論板數(shù)按歐前胡素峰計(jì)算應(yīng)不低于8 000。在此條件下，色譜圖見(jiàn)圖1。

2．2 溶液制備

圖1 高效液相色譜圖

精密稱(chēng)取歐前胡素對(duì)照品5．71 mg，置100 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取續(xù)濾液5 mL，置50 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液。參考2010年版《中國(guó)藥典（一部）》中白芷原藥材的含量測(cè)定方法[2]，取本品，研細(xì)，取約5 g，精密稱(chēng)定，置100 mL具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱(chēng)定質(zhì)量，超聲45 min，放冷，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量。精密量取續(xù)濾液25 mL，蒸干，用甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。按骨刺丸中處方比例精密稱(chēng)取全方中除白芷外的其他藥材，按供試品溶液的制備方法制備成陰性對(duì)照品溶液。

2．3 方法學(xué)考察

陰性干擾試驗(yàn)：按取2．2項(xiàng)下3種溶液適量，擬訂方法測(cè)定。結(jié)果陰性對(duì)照品溶液色譜中在主成分出峰處無(wú)干擾峰（見(jiàn)圖1）。

線性關(guān)系考察：精密吸取對(duì)照品溶液 5．0，8．0，10．0，12．0，15．0，20．0 μL，分別注入高效液相色譜儀，記錄峰面積。以對(duì)照品進(jìn)樣量（X）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y＝1 966．58X－0．666，r＝0．999 8（n＝6）。結(jié)果表明，歐前胡素進(jìn)樣量在0．028 4～0．113 7 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

精密度試驗(yàn)：取同一對(duì)照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣5次。結(jié)果的RSD為0．15%（n＝5），表明儀器的精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一樣品（批號(hào)為120601）5份，依法制備供試品溶液，分別進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算含量。結(jié)果歐前胡素含量的RSD為1．56%（n＝5），表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一份供試品溶液（批號(hào)為120601），分別于0，1，2，4，8，12，24 h 時(shí)進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果歐前胡素含量的RSD為1．27%（n＝7），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

加樣回收試驗(yàn)：取已知含量的樣品（批號(hào)為120601，含量為0．027 mg／g），精密稱(chēng)定，共取6份，每份中精密加入歐前胡素對(duì)照品溶液，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件測(cè)定。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 歐前胡素加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）

2．4 樣品含量測(cè)定

取3批樣品，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積，按外標(biāo)法計(jì)算含量。結(jié)果批號(hào)分別為111105，120203，120601 的樣品中歐前胡素含量分別為 0．029，0．026，0．027 mg ／g。

3 討論

通過(guò)試驗(yàn)得知，歐前胡素在300 nm波長(zhǎng)處有較大吸收[2]，其他成分在該波長(zhǎng)處無(wú)干擾，因此選擇300 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

在對(duì)流動(dòng)相進(jìn)行選擇時(shí)，考察了甲醇－水、乙腈－水以及兩者的不同比例，結(jié)果以甲醇－水（60∶40）為流動(dòng)相，所得色譜峰峰形較好，陰性無(wú)干擾，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確。

選擇樣品提取方法時(shí)，考察了超聲30，45，60 min，熱回流30，45，60 min，結(jié)果發(fā)現(xiàn)超聲45 min與60 min時(shí)結(jié)果無(wú)明顯差異，熱回流與超聲的結(jié)果基本一致，因此選擇超聲45 min提取樣品，操作簡(jiǎn)單方便。

[1]國(guó)家藥典委員會(huì)．中華人民共和國(guó)藥典（一部）[M]．北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：889 －890．

[2]YBZ17512005，國(guó)家藥品監(jiān)督管理局標(biāo)準(zhǔn)（試行）[S]．