代料配方與傳統松木栽培茯苓的質量分析比較研究*

楊 祺，周元科，黃 婕，孫盼盼，劉焱文

（湖北中醫藥大學藥學院，湖北省中藥資源與中藥化學重點實驗室，武漢 430061）

茯苓是多孔菌科真菌Poria cocos（Schw.）Wolf的干燥菌核，其菌種寄生于松木的根莖繁殖而成。茯苓為中國特有藥食兩用中藥，史載于古典醫著《神龍本草》，列為上品；收載于歷年版《中國藥典》一部，具有滲濕利尿、和胃健脾、寧心安神的功效[1]。現代臨床研究表明，茯苓及其配方具有抗疲勞、抗腦卒中后抑郁、治療慢性腎小球腎炎、腹瀉等療效[2-5]。茯苓廣泛應用于藥品和食品行業，為中藥大品種。據第3次全國中藥資源普查統計，該藥材每年的需求量為1.5萬噸以上[6]。由于歷年過度采挖，中國野生茯苓藥材極為稀少，瀕臨滅絕，所需藥材依賴人工栽培。傳統栽培茯苓方法是砍伐松木作為菌種繁殖藥材的原料，每年消耗大量的松木，嚴重影響生態環境。因此，尋找替代松木栽培茯苓的原料是我國科學工作者面臨的重要研究課題。筆者對茯苓藥材的資源調查、藥效物質基礎、質量分析、規范化種植等[7-10]進行了多年的研究。在前期研究基礎上，近年來筆者開展了代料配方栽培茯苓的研究工作，以期尋求代替松木栽培的原料。本研究采用現代儀器分析方法對代料配方與傳統松木栽培茯苓的有效成分含量進行比對分析研究，從而為代料栽培茯苓的應用前景提供了參考依據。

1 儀器與材料

Agilent1100高效液相色譜儀，UV-2401紫外檢測器，Agilent色譜工作站（美國Agilent公司），UV-2401紫外可見分光光度計（日本島津），KQ3200DE型超聲波清洗儀 (昆山市超聲儀器有限公司)，Sartonus型電子天平（十萬分之一，德國）。

代料配方見表1，代料配方與傳統松木栽培茯苓藥材為本項目組在羅田九資河種植，經本院鑒定教研室吳和珍教授鑒定為定為多孔菌科真菌茯苓Poria cocos（Schw.）Wolf，通過發汗，去皮，切塊，陰干，粉碎過60目篩。菌種均為同仁堂1號（T1），由湖北省中醫藥研究院提供。茯苓酸對照品為本實驗自制。乙腈為色譜純，水為重蒸餾水，其他試劑為分析純。

2 方法與結果

2.1 總多糖的含量測定 參考文獻[11]。

2.1.1 苯酚溶液的制備 取苯酚50 g，加鋁片0.05 g和碳酸氫鈉0.025 g，置于圓底燒瓶，常壓蒸餾并收集182℃的餾分，冷卻后稱取餾分5.00g，置于100mL量瓶中，加蒸餾水95 mL稀釋至刻度，搖勻，濾過至棕色試劑瓶，搖勻，即得5%苯酚溶液。

2.1.2 多糖的提取純化方法 精密稱取茯苓粉末1.0000 g，置于 50 mL 燒瓶中，加 25 mL（60～90）石油醚于80℃水浴回流2h，冷卻，過濾，濾渣揮干溶劑置于200mL燒杯中，加0.1mol/LNaOH溶液100mL，冰浴攪拌1 h（＜5℃），混合溶液以3000 r/min的速度離心分離20 min，取上清液，用10%冰乙酸溶液調pH值至5～6，待其成黏糊狀，將糊狀物離心，棄上清液，再次離心并棄上清液，下層得白色凝膠狀沉淀，即為茯苓總多糖。

表1 6種栽培茯苓樣品的代料配方Tab.1 Six kinds of substitutes synergy ingredients

2.1.3 供試品溶液制備 取上述茯苓多糖，約1 g，精密稱定，置于100 mL容量瓶中，加水混溶解至刻度，緩慢攪拌均勻，再吸取0.25 mL至10 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，即為茯苓多糖供試品溶液。

2.1.4 對照品溶液的制備 精密稱取減壓干燥至恒重的無水葡萄糖對照品0.00152 g，置于25 mL棕色容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻得0.0608 g/L的對照品溶液。

2.1.5 樣品的測定 分別精密稱取各代料配方樣品茯苓粉末約1.0000 g各3份（平行測定3份），按照上述方法制得供試品溶液，精密量取2.0 mL供試品溶液于20 mL試管中，分別加入5%苯酚溶液1.75 mL，充分混合后，緩慢加入6.0 mL濃硫酸，迅速搖勻，放置40 min，在紫外可見分光光度計上，于490 nm處測定樣品的吸光度值（平均值），見表2。

2.2 總三萜的含量測定 參考文獻[11]。

2.2.1 對照品溶液制備 精密稱取茯苓酸對照品0.00251 g，置于25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，備用，即為濃度0.1004 g/L的對照品溶液。

2.2.2 樣品的測定 精密稱取各代料樣品茯苓粉末約0.5000 g，精密稱定，置25 mL量瓶中，加入甲醇15 mL，超聲提取90 min，過濾，用適量甲醇洗滌藥渣，定容至刻度，搖勻。吸取0.4 mL于10 mL的具塞試管中，水浴揮干溶劑，冷卻，準確加入0.4 mL 5%香草醛冰醋酸溶液和1.8 mL高氯酸，混勻，蓋塞，置70℃恒溫水浴加熱20 min，取出，冷卻至室溫，加入冰醋酸5 mL，搖勻，于540 nm處測定吸光度，結果見表3。

表2 代料配方與傳統松木栽培茯苓的多糖含量測定Tab.2 The total polysaccharides determination results of Fuling and substitute cultivated Fuling

表3 不同代料茯苓總三萜含量的測定結果Tab.3 The total triterpenoid determination results of Fuling and substitute cultivated Fuling

2.3 茯苓酸的含量測定 參考文獻[12-15]。

2.3.1 色譜條件 色譜柱型號：Kromasil 100-5 C18（250 mm×4.6 mm，5μm），柱溫：30℃，流動相：乙腈－0.2%乙酸（82∶18），流速：1.0mL/min，檢測波長：210nm。色譜圖見圖1。

2.3.2 對照品溶液制備 精密稱取茯苓酸對照品2.0214 mg，置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，密封，即得濃度為0.2022 g/L的茯苓酸對照品溶液。

2.3.3 供試品溶液制備 精密稱取茯苓粉末約0.5000 g，精密稱定，置于50 mL具塞錐形瓶中，準確加入甲醇15 mL及10 mL，加塞精密稱定，超聲兩次，每次30 min，放置室溫后濾過，甲醇洗滌濾渣，合并濾液，定容至25 mL。精密吸取續濾液5 mL于蒸發皿中，水浴揮干，用甲醇溶解殘渣至2 mL量瓶中，即得。

圖1 測定樣品茯苓HPLC圖Fig.1 The HPLC figure of Fuling

2.3.4 樣品的測定 稱取各代料樣品的茯苓粉末，約0.5 g，精密稱定。按照上述方法制備供試品溶液，用0.45 μm微孔濾膜過濾，濾液密封備用，分別精密吸取各供試品溶液10 μL，注入液相色譜儀，按上述色譜條件測定并計算茯苓酸的含量，結果見表4。

表4 代料配方與傳統松木栽培的有效成分茯苓酸的含量測定Tab.4 The Poria acid assay results of Fuling and substitute cultivated Fuling

2.4 茯苓提取物的干膏收率的測定

2.4.1 茯苓醇提物的測定 將各代料樣品的茯苓飲片加8倍量的70%的乙醇回流提取2次，每次分別為2 h、1 h，過濾，合并濾液，揮干溶劑，干燥恒重，測定醇提物的干膏得率。

2.4.2 茯苓水提物的制備 將上述乙醇提取后的藥渣用8倍量的水回流提取3次，每次1 h，過濾，合并濾液，蒸干，恒重，測定水提物的收率。

2.4.3 茯苓堿水提取物測定 再將上述水提后的藥渣采用70倍量的0.5 mol/L NaOH攪拌提取1 h，過濾，濾液用HCL中和，離心，除鹽，再離心，干燥恒重，測定堿水提取物的收得率。

上述3種提取物干膏得率其測定結果見表5。

2.5 代料配方與傳統松木栽培茯苓質量分析的加權綜合評價 將代料配方與傳統松木栽培茯苓各供試樣品測定的總多糖、總三萜、茯苓酸、醇提物、水提物、堿水提取物等指標，采用Excel2007軟件處理，加權綜合評分，評價結果見表6。

表5 代料配方與傳統松木栽培茯苓的3種提取物收得率Tab.5 Three extracts of dry extract of Fuling and substitute cultivated Fuling %

3 討論

根據諸多文獻報道，以及前期研究結果表明，茯苓的主要有效成分為茯苓多糖和茯苓三萜類成分。本研究以茯苓多糖、總三萜、茯苓酸（三萜類成分）、茯苓提取物為考察指標，對代料配方與傳統松木栽培茯苓進行質量分析比對研究。研究結果表明，代料配方栽培茯苓的多數測定指標優于傳統松木栽培茯苓；加權綜合評價統計分析結果表明，代料配方栽培茯苓各組得分均高于傳統松木對照組，傳統松木栽培茯苓組排次末位。因此本研究證明了代料栽培茯苓的質量優于傳統松木栽培茯苓，從而為代料栽培茯苓的應用前景提供科學依據，對于保護松林生態環境具有潛在意義。

加權綜合評分結果表明，6種代料配方栽培茯苓的質量存在較大的差異。代料配方C和F實驗組得分最高，其排名位次并列第一，其他代料配方實驗得分順序為F>A>D>B。因此本項目統計分析結果為代料配方栽培茯苓的后期研究奠定了良好的基礎。擬分析和調整代料配方的物料組成或配伍比例，進一步開展代料栽培茯苓研究，優選最佳代料配方。

表6 茯苓及代料茯苓有效成分的綜合評分Tab.6 Composite scores of the active ingredient of Fuling and substitute cultivated Fuling

尋求替代松木栽培茯苓的代料配方研究已進行了多年，至今難以推廣應用主要存在兩個關鍵問題，即產量低和成本較高。在后期研究工作中將針對提高栽培茯苓產量和降低栽培成本的關鍵問題，優選栽培茯苓的最佳代料配方。

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