發酵駝乳源生物活性肽的提取分離和免疫調節活性評價

巴合提·烏拉孜別克，劉紅梅，新華·那比

(新疆醫科大學 a.藥理教研室；b.高職學院機能教研室,烏魯木齊 830011)

0 引 言

發酵制品食用在中亞具有悠久歷史，是哈薩克族及蒙古族等游牧民族常作為藥食兼用的功能性食品。本課題組歷盡十年研究發現乳酪乳清(哈族傳統制作的發酵食品)富含益生菌及生物活性肽具有抗動脈粥樣硬化作用。發酵駝乳也是傳統乳飲品。民間用于輔助治療結核病和糖尿病[1]。

本課題組研究結果顯示發酵駝乳具有抗炎作用，可能與其免疫調節作用有關[2],免疫學發展使得食品中特定的天然功能因子對調節免疫功能、抵抗慢性炎癥和損傷的作用越來越清楚。利用食品功能因子調節免疫系統成為一個重要的研究內容。本研究提取分離發酵駝乳中不同的組分，并研究其對淋巴細胞增殖和細胞因子的影響，為其免疫調節機制提供初步的理論依據。

1 實 驗

1.1 材料

1.1.1 新疆傳統發酵駝乳樣品來源

新疆傳統發酵駝乳購于新疆維吾爾自治區昌吉州呼圖壁縣牧區。

1.1.2 動物來源

體重20±2 g，雄性，昆明種小鼠[SCXK(新)2003-0001]購自新疆醫科大學動物中心。

1.1.3 儀器與試劑

超濾裝置，超濾膜(內壓式Ps-10，分子量截留值為10 000)；Sephadex G-50，RE-52型旋轉蒸發儀，冷凍干燥機，超凈操作臺，5%CO2培養箱；96孔培養板，RPMI-1640培養基，細胞計數試劑盒-8(CCK-8)，淋巴細胞分離液，胎牛血清(FBS)，磷酸緩沖溶液(PBS)，小鼠IFN-γ和IL-4 ELISA試劑盒。

1.2 方法

1.2.1 乳清的分離及超濾

發酵駝乳以3 000 r/min，離心45 min，分離得到乳清。采用分子量截留值為10kua的超濾膜對乳清進行超濾，并將超濾液濃縮，冷凍干燥得到粗品。

1.2.2 超濾物的凝膠層析

采用Sephadex G-50凝膠層析柱分離分子量10 ku以下粗品。首先用蒸餾水溶脹Sephadex G-50粉末，裝住，平衡。設柱體積：1.7 cm×85 cm,流動相與洗脫液均為蒸餾水；超濾凍干粉質量濃度為1 g/L。確定最佳流速與上樣量：(1)流速的選擇：0.3，0.5，0.8 mL/min對樣品進行洗脫，對照洗脫圖譜選擇合適的流速。(2)選擇上樣量為2，3.5，5 mL進行試驗，對照洗脫圖譜選擇合適的上樣量。進行分離，每3 mL收集液在紫外檢測器測定214 nm處吸收值，合并出峰時間相同收集液，濃縮，冷凍干燥，保存于-20℃。

1.2.3 小鼠脾淋巴細胞懸液的制備[3]

取(20±2)g，雄性，昆明小鼠眼球放血，處死，無菌超凈臺上取出脾臟，置200目尼龍篩上,用無菌注射器芯研磨，過篩的細胞收集于盛有磷酸緩沖液(PBS)的無菌培養皿中。加入適量淋巴細胞分離液，在室溫下以2 000 r/min，水平離心30 min，用吸管吸取淋巴細胞云霧層移入另一離心管中，用PBS洗滌3次。重懸于含10%熱滅活胎牛血清，濃度為2.05 mmol/L左旋谷氨酰胺，0.1%青-鏈雙抗溶液的完全RPMI-1640培養液中，細胞懸液濃度調至1×105mL-1，并用胎盤藍溶液測定細胞存活率。

1.2.4 各凝膠層析組分細胞增殖活性的評價[4]

分別設立空白對照組，陽性對照組和實驗組(組分a，b，c，d)， 檢測不同組分對脾臟淋巴細胞增殖的影響。備好的小鼠脾淋巴細胞懸液接種于96孔培養板(100 μL/孔)上述每組6孔，在質量分數為5%CO2，37℃的培養箱中預孵育4小時。將各凝膠層析組分溶于蒸餾水中，每組分備兩個質量濃度(0.1,0.25 g/L和0.5g/L)，用0.22 μm慮膜過濾，加至實驗組(100 μL/孔)。陽性對照組加入終質量濃度為5 mg/L的ConA(100 μL/孔)， 空白對照組加入等體積RPMI-1640培養液。繼續孵育44小時后，無菌，避光條件下每孔加入10 μL ccK-8溶液，再培養4 h，用酶標儀測定450 nm處光密度(OD)，計算刺激指數(SI)。各組分對淋巴細胞的刺激指數(SI)=實驗孔或陽性對照孔OD值/空白對照孔OD值[5]。

1.2.5 測定肽段C對淋巴細胞表達IFN-γ與IL-4水平的影響

采用酶聯免疫 (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA)法[6]評價肽段C對小鼠脾淋巴細胞表達IFN-γ與IL-4的影響。按照1.2.4所述淋巴細胞培養48 h后，以1 500 r/min離心10 mins細胞懸液，收集上清，嚴格按照ELISA試劑盒說明書操作，測定細胞上清IFN-γ與IL-4質量濃度。分別設提取物C組(0.1,0.25 g/L和0.5 g/L)，空白對照組和陽性對照組。

1.2.6 統計分析

實驗數據用x±S表示,采用SPSS 13.0統計軟件進行統計分析。單因素方差分析后進行組間t檢驗，檢驗水準為α=0.05，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 凝膠層析分離超濾物

離心發酵駝乳分離乳清，進一步采用超濾法得到小于10 ku分子量的粗品，濃縮，冷凍干燥。考察Sephadex G-50柱分離條件并確定：流速0.5 mL/mim，上樣量2 mL。共得到4個組分，結果如圖1～圖3所示。

圖1 凝膠層析上樣量對組分分離的影響

圖2 凝膠層析流速對組分分離的影響

圖3 凝膠層析分離所得的各組分

2.2 各凝膠層系組分的促淋巴細胞增殖活性

發酵駝乳源生物活性物質對小鼠脾淋巴細胞增殖能力的影響：與空白對照組比較，凝膠層析肽段c組(0.25，0.5 mg/L)OD值為0.58±0.014，0.59±0.018，(P＜0.05)， 淋巴細胞的刺激指數分別為1.26±0.015，1.3±0.010(P＜0.05)。說明肽段C脾淋巴細胞增殖能力顯著增高于空白組以及其余肽段刺激組。結果如表1和圖4所示。

表1 凝膠層析各組分對小鼠脾淋巴細胞增值率的影響(±s)

表1 凝膠層析各組分對小鼠脾淋巴細胞增值率的影響(±s)

注：*為與其他組相比，有統計學差異，n=6。下同。

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表2 凝膠層析各組分刺激小鼠脾淋巴細胞指數(±s)

表2 凝膠層析各組分刺激小鼠脾淋巴細胞指數(±s)

注：*為與其他組相比，有統計學差異，n=6。

組別肽段a肽段b肽段c肽段d空白ConA(5 mg/L)SI值(實驗組OD/空白組OD)0.1 g/mL 0.97±0.024 0.99±0.020 1.01±0.021 0.99±0.047 0.25 g/mL 0.99±0.012 1.00±0.012 1.26±0.015*1.00±0.003 1.00±0.002 1.76±0.013*0.5 g/mL 1.01±0.014 0.98±0.017 1.30±0.010*0.99±0.001

圖4 各組分對小鼠脾淋巴細胞增殖的影響

表3 凝膠層析各組間小鼠脾淋巴細胞刺激指數差異(x±s)

肽段c與其余各肽段之間差異有統計學意義(P＜0.05)

2.3 肽段C對淋巴細胞表達IFN-γ與IL-4水平的影響

ELISA法測得肽段C組和空白對照組，陽性對照組IFN-γ與IL-4表達水平。組間比較，肽段C組IFN-γ含量相對于空白對照組明顯增高(P＜0.05)，而兩組IL-4表達無統計學差異(P＞0.05)，結果如表4所示。

表4 肽段C對細胞上清IFN-γ與IL-4含量的影響(±s)

表4 肽段C對細胞上清IFN-γ與IL-4含量的影響(±s)

注：*為與其他組相比，有統計學差異，n=6。

肽段c組0.1 g/L 0.25 g/L 0.5 g/L空白組ConA組IFN-γ 0.14±0.020 0.22±0.021觹0.23±0.015觹0.15±0.014 0.61±0.012觹IL-4 0.13±0.015 0.13±0.023 0.14±0.011 0.13±0.017 0.23±0.018觹

3 結 論

本研究主要針對發酵駝乳源生物活性肽的提取分離，并通過體外細胞培養方法測定各肽段免疫調節活性。其免疫調節活性的評價即測定各肽段對小鼠脾淋巴細胞增殖和細胞因子表達水平的影響[5]。細胞增殖性強弱反應細胞生存能力與功能狀態。當細胞受到生理性與病理性因素損傷，機體免疫力下降時，首先表現出增殖活性的降低。而細胞因子IFN-γ能促進免疫應答，是抗結核感染免疫反應中的關鍵細胞因子[7]。

基于前期種種研究發現，本研究首先對發酵駝乳蛋白及小分子生物活性肽的部分提取工藝進行考察，并更深入探討發酵駝乳蛋白及小分子生物活性物肽對小鼠脾淋巴細胞增殖以及細胞因子表達的影響。實驗結果表明，部分發酵駝乳源生物活性肽對小鼠脾淋巴細胞的體外增值有一定的作用，并可以從細胞因子IFN-γ表達水平也可證明這一點，初步評價發酵駝乳在小鼠免疫反應中的調節作用。

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