一株沙雷氏菌的分離及其群體感應現象

張彩麗 朱素琴 汪映 孫秀嬌 曾名湧

（中國海洋大學食品科學與工程學院，青島 266003）

群體感應（Quorum sensing，QS）［1]是細菌之間相互交流的一種方式，細菌通過產生一種自誘導物（Autoinduced，AI）而相互感知，自誘導物隨著細菌密度增加而增加，當達到一定閾值時，會誘導細菌某些特定基因的表達。自1970年首次發現費氏弧菌（V. fischei）的發光［2]與細菌密度有關以來，許多研究證明群體感應可調控細菌的生理特性，如銅綠假單胞菌（P.aeruginosa）生物膜的形成［3]，副溶血弧菌（V. parahaemolyticus）胞外酶的分泌［4]及霍亂弧菌（V. cholerae）毒力因子［5]的表達等。革蘭氏陰性菌主要存在LuxI/LuxR系統并以N-酰基高絲氨酸內酯類（N-acyl-homoserine lactones，AHLs）［6]物質作為信號分子，其中LuxI蛋白負責信號分子的合成，LuxR蛋白作為信號分子受體，通過形成受體-自誘導物復合體，啟動目的基因的轉錄表達。革蘭氏陽性菌［7]通過雙組分的群體感應系統分泌寡肽類（Autoinducing peptides，AIPs）信號分子。Bassler［8]在哈維氏弧菌（V. harveyi）中發現了一種依賴于LuxS蛋白的細菌間交流的信號分子（Autoinducer-2，AI-2），并證明AI-2是一種呋喃酮硼酸二酯（Furanosyl borate diester）。

沙雷氏菌（Serratia marcescens）是腸桿菌科的一種條件致病菌［9]，存在于土壤、水、植物、動物以及人類的腸道和呼吸道中，在機體免疫力降低或環境污染時，可引起原發性和不同程度的繼發性感染。該菌屬能夠產生核酸酶、蛋白酶、脂肪酶等次級代謝產物對人類存在潛在危害。目前已有研究證明沙雷氏菌的生物膜形成、群集運動等性狀受群體感應調控［10]。因此，研究水產品中沙雷氏菌的群體感應，將為沙雷氏菌的防治和水產品的保鮮提供理論指導。

本試驗從腐敗凡納濱對蝦中分離出一株具有群體感應現象的沙雷氏菌S.marcescensAK1，并對其群體感應信號分子進行檢測，旨為沙雷氏菌群體感應調控的致病性研究提供一定科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗菌株 菌株S. marcescensAK1分離于腐敗的凡納濱對蝦中，保存于本實驗室。群體感應報告菌株紫色桿菌（Chromobacterium violaceum）CV026和根癌農桿菌（Agrobacterium tumefaciens）A136（pCF218）（pCF372）均由美國德克薩斯州立大學McLean RJC教授惠贈。CV026可檢測碳鏈長度從C4到C8［11]的信號分子，而A136可檢測較寬范圍的信號分子［12]，從C4到C14，3-oxo-C4到3-oxo-C12均可檢測。CV026和A136本身均不產生AHLs，當存在外源AHLs時，紫色桿菌CV026將產生紫色桿菌素；根癌農桿菌A136表達lacZ基因，分解X-gal產生藍色。

1.1.2 培養基和培養條件 菌株S. marcescensAK1、CV026、A136在30℃下培養于LB肉湯或LB瓊脂培養基中［13]。CV026需添加50 μg/mL的卡那霉素，A136添加4.5 μg/mL四環素和50 μg/mL壯觀霉素。

1.1.3 主要試劑和儀器 X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-吡喃半乳糖苷）、壯觀霉素、四環素、卡那霉素、N-酰基高絲氨酸內酯（C6-HSL、C8-HSL、3-oxo-C6-HSL）購自Sigma公司；RP-C18 F254反相薄層層析板購自德國Merck公司。

1.2 方法

1.2.1 分離純化菌株 從腐敗的蝦中利用平板稀釋法進行細菌的分離、純化。根據細菌菌落特征、革蘭氏染色、鏡檢、生理生化試驗對菌株AK1進行鑒定。

1.2.2 提取菌株16S rRNA 菌株AK1液體條件下培養至生長對數期（OD≈1.0），取2 mL新鮮菌液10 000 r/min離心2 min后棄去上清，利用EZ-10柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒（上海生工生物工程股份有限公司）提取基因組DNA，所得DNA于-20℃保存。以提取DNA為模板擴增16S rRNA，PCR體系為50 μL：模板3 μL，dNTPs（2.5 mmol/L）5 μL，引物（1 mmol/L）各1 μL，10×Taq緩沖5 μL，MgCl23 μL，Taq酶1 μL，滅菌超純水31 μL。PCR引物序列為27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；1492R：5'-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3'。PCR反應條件：95℃ 5 min，95℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃1 min，共30個循環后，72℃10 min。將PCR產物利用0.6%瓊脂糖凝膠電泳。PCR產物送往上海生工生物工程股份有限公司測序。

1.2.3 檢測菌株群體感應現象

1.2.3.1 報告菌株平板劃線法 根據文獻［14] 的方法，將被檢測菌株與報告菌株CV026在LB平板上平行劃線；用報告菌株A136時，需先在LB平板上涂布20 μL X-gal（20 mg/mL），無菌風吹干后，28℃培養18-24 h觀察。分別以報告菌株自身作為陰性對照，以C6-HSL作為陽性對照。

1.2.3.2 制備粗提液 菌株AK1在LB肉湯中過夜培養至一定密度（OD≈1.0），10 000 r/min離心5 min，取上清，用等量乙酸乙酯提取3次，混合有機相，30℃水浴旋蒸至干，溶解于1 mL甲醇，-20℃保存備用。

1.2.3.3 TLC-Biosensor檢測 分別將信號分子標準品與乙酸乙酯提取物2-5 μL點樣于C18反相薄層層析板，利用甲醇/水（6040，V/V）充分展開，取出后在常溫下揮干溶劑，按制備報告平板方法制備含A136菌、抗生素、X-gal的瓊脂，傾到于薄層層析板上，凝固后，28℃培養18-24 h觀察。以不含A136菌的瓊脂覆蓋作對照。

1.2.4 測定不同時間信號分子含量 過夜活化的菌株AK1接種于液體LB培養基，每隔4 h取50 mL菌液，按照1.3.2方法提取信號分子。參照文獻［15] 略作修改，β-半乳糖苷酶法檢測信號分子活性，96孔板中依次加入100 μL生理鹽水、100 μL過夜培養A136（OD≈1.0），2.5 μL X-gal，2.5 μL提取物，以LB液體培養基提取物做對照，28℃搖床（150 r/min）培養8-12 h，測定A635。按照1.2.3.1方法制備含A136菌、抗生素、X-gal的報告平板，點樣2 μL提取物于滅菌圓紙片，無菌風吹干，放置報告平板上，28℃培養18-24 h觀察。

2 結果

2.1 菌株生化試驗

將分離純化的細菌進行生理生化試驗，結果顯示，AK1革蘭氏染色陰性、氧化酶試驗陰性和葡萄糖酸鹽試驗陽性、苯丙氨酸脫氨酶試驗陰性；不能產H2S；能利用葡萄糖、乳糖、果糖、海藻糖、山梨醇發酵產酸；不能利用阿拉伯糖；賴氨酸脫羧酶陽性、DNA酶試驗陽性，β-半乳糖苷酶陽性。根據伯杰士手冊和腸桿菌科檢索系統［16]鑒定其為黏質沙雷氏菌。

2.2 16S rRNA

將菌株AK1的16S rRNA（圖1）序列提交NCBI數據庫進行Blast比對，結果顯示該菌株與沙雷氏菌序列相似度超過99%。利用ClustalX1.8 軟件排序，MEGA4.1軟件按照Neighbour-Joining聚類，構建系統發育樹如圖2所示。

圖1 菌株AK1的16S rRNA PCR擴增產物電泳圖

圖2 沙雷氏菌AK1與其他沙雷氏菌之間的系統發育關系

2.3 平板劃線法檢測群體感應

報告菌株CV026和A136與待測菌株AK1平行劃線結果如圖3所示，菌株AK1可以誘導紫色桿菌CV026產生紫色色素，誘導A136水解X-gal產生藍色。陰性對照無顏色變化，陽性對照分別產生紫色和藍色。因菌株AK1具有β-半乳糖苷酶活性，所以在A136平板上可看到菌株AK1也變為藍色。

2.4 TLC-Biosensor

反相薄層層析法分析結果顯示，對照不產生藍色，表明粗提物不是能水解X-gal的β-半乳糖苷酶。含A136的TLC板顯示烷酰基類型信號分子遷移良好，形成規整圓形，而氧代信號分子則具有拖尾現象。根據遷移值及形狀與標準品比對，菌株AK1可以產生兩種信號分子C6-HSL和3-oxo-C6-HSL。報告菌株A136對氧代信號分子較敏感，圖4顯示3-oxo-C6-HSL顯色范圍較大。該菌產生的信號分子類型可能還有其他種類，其含量可能因太低而無法利用TLCBiosensor方法檢測到，信號分子的進一步確定需依賴于HPLC/MS或GC/MS。

圖3 利用報告菌株CV026和A136分別平行劃線檢測菌株AK1信號分子

圖4 TLC檢測AHLs

2.5 不同時間信號分子含量

菌株AK1不同時間的信號分子分泌規律（圖5）顯示，菌株AK1在對數前期便開始產生信號分子且具有密度依賴性，對數后期（約16 h）達到最大值（約為對數前期的3.2倍），隨著細菌進入衰亡期，信號分子的含量也減少。報告平板法結果（圖6）與此一致。測定培養基的pH值，到達穩定期后，由于次級代謝產物的積累，培養基pH值從開始的pH6.97（0 h）增加到pH7.40（16 h），并在穩定期達到pH8.10（24 h）。N-酰基高絲氨酸在堿性條件下不穩定，信號分子的減少可能由于培養基pH值的改變。

圖5 β-半乳糖苷酶法檢測菌株AK1上清中AHLs變化

圖6 利用報告菌株A136檢測菌株AK1上清中AHLs變化

3 討論

革蘭氏陰性菌利用N-酰基高絲氨酸內酯類化合物作為相互交流的信號分子［17]早有報道，國內外基于AHLs生物表達報告基因（如lacZ，gfp，luxCDABEG）已構建多種不同特異性的基因工程菌株。本研究利用群體感應報告菌株CV026和A136對腐敗凡納濱對蝦中分離的粘質沙雷氏菌AK1的群體感應進行檢測，均呈現陽性結果。利用TLCBiosensor法檢測信號分子類型，結果顯示菌株AK1能產生3-oxo-C6-HSL和C6-HSL信號分子，與Yu TzeHorng 報道的S. marcescensSS-1［18]產生的信號分子類型一致，S. marcescensSS-1可產生至少4種群體感應信號分子3-oxo-C6-HSL、C6-HSL、C7-HSL和C8-HSL。S. marcescensMG1，S. plymuthicaRVH1和S. proteamaculansB5a均可產生C6-HSL。可見，C6-HSL信號分子在沙雷氏菌屬中較為普遍。菌株AK1可能還產生其他類型信號分子，需借助更靈敏方法進行鑒定。AK1產生的兩種信號分子中，3-oxo-C6-HSL含量較為豐富，而C6-HSL相對較低。同時，利用β-半乳糖苷酶法和報告菌株法對菌株AK1產信號分子能力進行評價，結果顯示AK1具有較強的信號分子產生能力，進入對數初期（約4 h）便可產生信號分子，對數末期（約16 h）達到最大值，約為對數初期的3.2倍。由于堿性次級代謝產物的產生或自身的利用，信號分子在穩定期減少但仍能維持較長時間。

沙雷氏菌易于存活，生物膜形成能力強，使其對環境和抗生素有較強的抵抗力，由于它具有鞭毛調節的群集運動分化行為，因而加大了其對自然界的侵襲能力。群體感應作為一種細菌相互交流的“語言”，當細菌釋放的信號分子達到一個臨界閾值時，會相互感知，協調它們之間的生理行為。群體感應調控沙雷氏菌的多種生理行為［19]，包括S.plymuthicaRVH1 核酸酶、蛋白酶、幾丁質酶的產生；Serratia spATCC 39006抗生素的產生；S. marcescensMG1生物膜的形成等。生物膜和群集運動增強了沙雷氏菌對環境和抗生素的抵抗力，對人類造成潛在危害，然而受群體感應調控的沙雷氏菌產生的某些抗生素和靈紅素［20]，具有抗菌、抗瘧原微生物活性。因此，探究沙雷氏菌的群體感應現象，可以為沙雷氏菌的防治和利用提供依據。

本試驗從腐敗的凡納濱對蝦中分離的沙雷氏菌AK1與大部分沙雷氏菌一樣能產生群體感應信號分子，但較于其他黏質沙雷氏菌，AK1顯示出的易于生存和極強的群體感應信號分子分泌能力，可能因為其分離環境不同，從水生環境分離后，通過迅速產生群體感應信號分子應對外界條件的改變。這些信號分子對水產品食源性疾病的爆發存在怎樣的威脅，沙雷氏菌與食品體系中的腐敗菌間存在怎樣的關系都有待進一步研究。通過對水產品中沙雷氏菌群體感應的研究，可以為條件致病菌沙雷氏菌的防治和水產品的保鮮提供一定的理論依據，為食品保鮮劑和殺菌劑的研究指出新方向。

4 結論

腐敗凡納濱對蝦中分離的黏質沙雷氏菌AK1具有極強的環境適應能力，能產生兩種類型信號分子，C6-HSL和3-oxo-C6-HSL，且氧代類型較為豐富。信號分子在對數初期即可產生，對數末期達到最大值，并能在穩定期維持較長時間。

［1] Fuqua WC, Winans SC, Greenberg EP. Quorum sensing in bacteria：the LuxR-LuxI family of cell density-responsive transcriptional regulators［J] . Journal of Bacteriology, 1994, 176（2）：269-275.

［2] Nealson KH, Platt T, Hastings JW. Cellular control of the synthesis and activity of the bacterial luminescent system［J] . Journal of Bacteriology, 1970, 104（1）：313-322.

［3] Davies DG, Parsek MR, Pearson JP, et al. The involvement of cell-tocell signals in the development of a bacterial biofilm［J] .Science,1998, 280（5361）：295-298.

［4] Lee CY, Su SC, Liaw RB. Molecular analysis of an extracellular protease gene fromVibrio parahaemolyticus［J] . Microbiology,1995, 141（10）：2569-2576.

［5] Miller MB, Skorupski K, Lenz DH, et al. Parallel quorum sensing systems converges to regulate virulence inVibrio cholera［J] . Cell,2002, 110（3）：303-314.

［6] Pongsilp N, Triplett EW, Sadowsky MJ. Detection of homoserine lactone-like quorum sensing molecules inBradyrhizobiumstrains［J] . Current Microbiology, 2005, 51（4）：250-254.

［7] Miller MB, Bassler BL. Quorum sensing in bacteria［J] . Annual Reviews in Microbiology, 2001, 55（1）：165-199.

［8] Schauder S, Shokat K, Surette MG, et al. The LuxS family of bacterial autoinducers：biosynthesis of a novel quorum-sensing signal molecule［J] . Molecular Microbiology, 2001, 41（2）：463-476.

［9] Grimont PAD, Grimont F, Richard C, et al. Deoxyribonucleic acid relatedness betweenSerratia plymuthicaand otherSerratiaspecies,with a description ofSerratia odoriferasp. nov.（type strain：ICPB 3995）［J] . International Journal of Systematic Bacteriology, 1978,28（4）：453-463.

［10] Rutherford ST, Bassler BL. Bacterial quorum sensing：its role in virulence and possibilities for its control［J] . Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine, 2012, 2（11）：1-25

［11] Mclean KH, Winston MK, Fish L, et al. Quorum sensing andChromobacterium violaceum：exploitation of violacein production and inhibition for the detection of N-acyl-homoserine lactones［J] . Microbiology, 1997, 143（12）：3703-3711.

［12] Zhu J, Beaber JW, Moré MI, et al. Analogs of the autoinducer 3-oxooctanoyl-homoserine lactone strongly inhibits activity of the TraR protein ofAgrobacterium tumefaciens［J] . Journal of Bacteriology, 1998, 180（20）：5398-5405.

［13] Rice SA, Koh KS, Queck SY, et al. Biofilm formation and sloughing inSerratia marcescensare controlled by quorum sensing and nutrient cues［J] . Journal of Bacteriology, 2005, 187（10）：3477-3485.

［14] Chu W, Vattem DA, Maitin V, et al. Bioassays of quorum sensing compounds using agro bacterium tumefaciensandChromobacterium violaceum［M] .Quorum Sensing. Humana Press, 2011：3-19.

［15] Tang K, Zhang Y, Yu M, et al. Evaluation of a new high-throughput method for identifying quorum quenching bacteria［J] . Scientific Reports, 2013, 3：1-9.

［16] 蔡妙英, 東秀珠. 腸桿菌科檢索系統［J] . 微生物學通報,1989, 5（19）：314-319.

［17] Bassler BL, Miller MB. Quorum Sensing［M] .The Prokaryotes.Springer Berlin Heidelberg, 2013：495-509.

［18] Horng YT, Deng SC, Daykin M, et al. The LuxR family protein SpnR functions as regulator of N-acyl-homoserine lactone dependent quorum sensing inSerratia marcescens［J] .Molecular Microbiology, 2002, 45（6）：1655-1671.

［19] Van Houdt R, Givskov M, Michiels CW. Quorum sensing inSerratia［J] . FEMS Microbiology Reviews, 2007, 31（4）：407-424.

［20] Holly S, Matthew C, Lee E, et al. Phosphate availability regulates biosynthesis of two antibiotics, prodigiosin and carbapenem, inSerratiavia both quorum-sensing-dependent and -independent pathways［J] . Molecular Microbiology, 2003, 47（2）：303-320.