嗜水氣單胞菌轉錄調控蛋白基因的克隆與序列分析

李雪 胡秀彩 蘭云 沈曉靜 呂愛軍 朱愛華

（江蘇師范大學生命科學學院，徐州 221 116）

嗜水氣單胞菌（A. hydrophila）是一種典型的魚、畜、人共患病病原菌［1，2]，主要致病因子包括外毒素、胞外蛋白酶等，并與轉錄調控蛋白AhyR基因有關［3]。研究表明，嗜水氣單胞菌AhyR基因調控溶血素、胞外蛋白酶等產生［4，5]。畢志香等［4，6]構建嗜水氣單胞菌J-1菌株AhyR基因突變株J-1△AhyR，發(fā)現AhyR基因與蛋白酶、溶血素、DNA酶等主要致病因子表達有關。嗜水氣單胞菌AhyR基因突變阻止產生N-酰基高絲氨酸內酯，從而進一步抑制蛋白酶的產生［5]。Swift等［7]報道嗜水氣單胞菌AhyR蛋白能夠促使胞外蛋白酶較早表達，有效防御病原菌侵入抵制感染。此外，AhyR蛋白與細菌群體感應信號調控蛋白LuxR功能類似，參與調控生物膜形成以及胞外蛋白酶產生［8，9]。關于魚源嗜水氣單胞菌AhyR基因的序列分析及其結構預測，目前尚未見文獻報道。本 研究從嗜水氣單胞菌Zf1菌株中克隆獲得AhyR基因，并對其編碼蛋白進行生物信息學分析，有助于理解嗜水氣單胞菌的分子致病機理。

1 材料與方法

1.1 材料

嗜水氣單胞菌Zf1菌株由本實驗室保藏。細菌基因組DNA提取試劑盒購自上海生工生物工程有限公司，pMD18-T Vector購自TaKaRa公司，UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒、PCR擴增試劑均購自上海捷瑞生物工程公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設計與合成 參考嗜水氣單胞菌AhyR基因序列（登錄號：YP_855090），設計特異性上下游引物（AhyR-F：CGATTGCGAAAGCGATAA；AhyR-R：CTGCTGAGCCATTGGTTTT）用于PCR擴增Zf1菌株AhyR基因，引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2.2 Zf1菌株AhyR基因克隆 參考李雪等［10]方法，將Zf1菌株接種于LB液體培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)12 h。取1 mL菌液用于提取基因組DNA，具體操作參照細菌基因組DNA提取試劑盒說明書。將提取到的基因組DNA用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，-20℃保存?zhèn)溆?。PCR擴增采用10 μL體系：提取的Zf1菌株基因組DNA模板1.0 μL，上下游引物各0.5 μL，Master Mix 5.0 μL，ddH2O 3 μL。PCR循環(huán)條件為：94℃預變性2 min，94℃變性45 s，50℃退火45 s，72℃延伸2 min，經30個循環(huán)后72℃再延伸10 min。得到目的條帶后，按照UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒說明書回收目的基因。將膠回收得到的DNA片段用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，-20℃保存?zhèn)溆?。將AhyR基因膠回收產物與pMD18-T載體連接，轉化到DH5α感受態(tài)細胞，陽性克隆菌樣送上海生工測序。

1.2.3 基因序列及其結構分析 用Edit seq推測氨基酸序列，利用Motif Scan、blastp程序預測結構域，NetPhos 2.0 Server預測磷酸化位點［11]。通過鄰接法（Neighbor-Joining），應用MEGA 5.1軟件構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹分析。將蛋白氨基酸序列提交SWISSMODEL預測三級結構，用RasMolVersion 2.7.5.2查看蛋白三級結構，并用拉馬錢德蘭圖（Ramachandran plot）檢測蛋白模型的合理性。

2 結果

2.1 Zf1菌株AhyR基因克隆及序列分析

PCR擴增得到一條特異性條帶（圖1），測序獲得AhyR基因大小為1 063 bp，引物序列見圖2，推測ORF編碼260 aa；查找結構域發(fā)現AhyR蛋白18-168 aa區(qū)域為自體誘導物結合域（PF03472），176-241 aa區(qū)域為LuxR型螺旋-轉角-螺旋DNA結合結構域（PS50043），183-227 aa區(qū)域為DNA結合域（PF04967）（圖3）；預測AhyR蛋白含有13個磷酸化位點，其中有8個絲氨酸（15S、62S、144S、145S、156S、173S、200S、227S）、3個蘇氨酸（30T、184T、188T、）和2個酪氨酸（161Y、231Y），進一步預測酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點（15S、173S、184T、199T）和蛋白激酶C磷酸化位點（173S、184T、210T、222T）（圖4）。

圖1 AhyR基因的PCR電泳

2.2 AhyR基因蛋白序列比對及系統(tǒng)進化樹分析

對AhyR蛋白進行多重序列比對表明氣單胞屬不同菌種AhyR氨基酸序列高度保守，與殺鮭氣單胞菌（A. salmonicida）、維隆氣單胞菌（A. veronii）、豚鼠氣單胞菌（A. caviae）、中間氣單胞菌（A. media）、簡達氣單胞菌（A. jandaei）序列同源性分別為100%、99.62%、99.23%、98.85%、94.23%。構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹分析顯示AhyR為LuxR同源蛋白之一，AhyR蛋白與嗜水氣單胞菌（登錄號YP_855090）的AhyR蛋白親緣性最近，自然聚為一支（圖5）。

2.3 AhyR基因編碼蛋白三級結構預測

圖2 Zf1菌株AhyR基因的上下游引物測序圖譜

圖3 AhyR蛋白blastp保守結構域圖

圖4 AhyR蛋白磷酸化位點預測

進一步分析AhyR蛋白三級結構，確定以群體感應控制阻遏物的A鏈（PDB：3SZT_A）為模板，該蛋白與模板相似性達28.40%，通過SWISSMODEL在線比較建模結果，如圖6-A所示，AhyR蛋白主要由15個α螺旋、5個β折疊和19個轉角構成，該三級結構與二級結構序列特征分析結果基本一致；圖6-B顯示LuxR型螺旋-轉角-螺旋結構域主要以α螺旋分布在三級結構C端外側。拉馬錢德蘭圖檢測結果（圖7）表明有93.9%氨基酸序列位于最適宜區(qū)，5.9%氨基酸序列位于允許區(qū)，證實AhyR基因推導蛋白的三級結構模型合理。

3 討論

圖5 鄰接法構建AhyR蛋白的系統(tǒng)進化樹

圖6 AhyR蛋白的3D結構預測圖

嗜水氣單胞菌致病因子主要包括外毒素、胞外蛋白酶等，還與轉錄調控蛋白AhyR基因有關［3]。AhyR蛋白在嗜水氣單胞菌蛋白酶活性調節(jié)中起重要作用，促使胞外蛋白酶較早表達，有效防御病原菌侵入抵制感染［7]。Bi等［4]利用自殺性重組質粒pJP-AhyR插入誘變嗜水氣單胞菌J-1菌株AhyR基因，構建該基因突變株J-1△AhyR，證實AhyR基因與嗜水氣單胞菌致病因子表達有關。Kirke等［8]報道嗜水氣單胞菌AhyR蛋白屬于LuxR型家族調控蛋白之一，AhyR基因能夠調節(jié)N-?；呓z氨酸內酯合成酶生成，與生物膜形成和細胞外蛋白酶產生有關。LuxR調控蛋白在革蘭氏陰性菌群體感應系統(tǒng)中與自體誘導物（Autoinducers，AI）信號傳遞分子結合［12]，進一步調控細菌多種生理活動［4-9]。此外，細菌轉錄調控蛋白PhoB、TraR與LuxR蛋白DNA結合域高度保守［13，14]。Shindoh等［13]認為大腸桿菌PhoB轉錄調控蛋白DNA結合域與磷酸鹽饑餓誘導激活基因調控有關。Vannini等［14]研究發(fā)現根癌土壤桿菌（Agrobacterium tumefaciens）TraR蛋白基因結合區(qū)位于DNA結合域和GAF/PAS結構域之間。AhyR蛋白N端自體誘導物結合域為信號分子結合區(qū)域，C端DNA結合域能與目的基因特異性結合，以調控轉錄活性［14，15]。本研究采用PCR方法擴增得到嗜水氣單胞菌Zf1菌株AhyR基因序列，預測含有自體誘導物結合域和LuxR型螺旋-轉角-螺旋DNA結合結構域，這與國外文獻報道［13，14]一致。此外還發(fā)現，以上兩個功能域為LuxR型家族調控蛋白獨有結構域，有待于進行AhyR基因功能的生物學驗證。

圖7 AhyR蛋白片段3D模型的拉馬錢德蘭圖分析

細菌轉錄調控蛋白（如UhpA、AhyR、LuxR等）磷酸化參與基因轉錄調控、細胞凋亡等生理病理過程，在感染致病過程中起重要調控作用［16-20]。因此，預測嗜水氣單胞菌AhyR蛋白的磷酸化位點有助于研究AhyR蛋白功能。Dahl等［18]研究大腸桿菌轉錄調控蛋白UhpA磷酸化后，能夠結合到糖磷酸轉運蛋白UhpT啟動子，實現UhpT蛋白表達。Ottosen等［19]鑒定單純皰疹病毒VP16轉錄調控蛋白5個磷酸化位點（18S、353S、375S、411S、452S），其中375S在VP16與Oct-1相互作用過程中發(fā)揮重要作用，這可能與病毒介導早期基因啟動及轉錄調控功能有關。Jeli?i?等［20]誘導酵母轉錄調控蛋白（Gal4）DNA結合域中7個絲氨酸位點突變，預測轉錄活性和與DNA結合能力，發(fā)現2個磷酸化位點（22S、85S），認為DNA結合域中的絲氨酸介導轉錄機制中蛋白質相互作用，從而穩(wěn)定激活子Gal4蛋白。本研究預測Zf1菌株AhyR蛋白含有13個磷酸化位點發(fā)現，173S、184T為酪蛋白激酶Ⅱ和蛋白激酶C磷酸化位點。此外，對氣單胞屬AhyR蛋白序列比對，結果表明氨基酸序列同源性高于90%，系統(tǒng)發(fā)育進化樹分析顯示AhyR為LuxR同源蛋白，這與鄭世超等［21]報道結果基本一致。進一步分析AhyR蛋白三級結構，以及拉馬錢德蘭圖檢測表明AhyR基因推導蛋白的三級結構模型合理，有助于進一步試驗驗證AhyR蛋白功能及其分子調控機制。

4 結論

獲得嗜水氣單胞菌Zf1菌株AhyR基因大小為1 063 bp，推導編碼260 aa，發(fā)現含有自體誘導物結合域（PF03472）、LuxR型螺旋-轉角-螺旋DNA結合結構域（PS50043）及13個磷酸化位點。AhyR蛋白三級結構顯示LuxR型螺旋-轉角-螺旋結構域主要以α螺旋分布在C端外側，與拉馬錢德蘭圖檢測分析AhyR蛋白空間結構基本一致。

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