兔豆狀囊尾蚴TpRS1基因的克隆及其序列分析

韓樂樂 李作磊 茍惠天 孫曉林

（甘肅農業大學動物醫學院，蘭州 730070）

豆狀囊尾蚴是帶科（Taeniidae）帶屬（Taenia）的豆狀帶絳蟲（Taenia pisiformis）的中絳期蚴蟲，常寄生于家兔等嚙齒動物的肝臟、大網膜、腸系膜和腹腔內引起其豆狀囊尾蚴病［1]。當終末宿主（如犬、狼、狐等）吞食了感染豆狀囊尾蚴的中間宿主組織后，豆狀囊尾蚴在其小腸中發育為豆狀帶絳蟲［2]。該病呈世界性分布［3-5]，我國各地均有發生［6]。該病的流行，不僅對公共衛生及兔肉食品安全構成嚴重威脅，而且給養殖業的發展造成嚴重影響。

目前，帶科絳蟲免疫診斷抗原的研究主要集中在一些低分子量抗原方面［7-10]。研究證明，在帶科絳蟲囊尾蚴病診斷中具有較好應用價值，如10、14和18 kD等抗原都屬于8 kD基因家族成員，只是糖基化修飾程度的差異而形成大小不同的蛋白分子。Ferrer等［7，11]對 8 kD抗原家族基因進行研究發 現，Ts8ku糖蛋白顯示出良好的免疫反應性，在豬囊尾蚴病診斷方面具有較高的應用價值。Sako等［12]使用多房棘球蚴Em18重組抗原建立的免疫層析檢測方法敏感性和特異性均達到94%以上。Yong等［13]對豬帶絳蟲RS1基因進行研究，發現其能夠與宿主的脂肪酸結合從而獲得能源，有助于絳蟲在宿主體內寄生，然而這種結合作用同時會受到RS1抗原的特異性抗體的抑制作用。Lee等［14]通過研究豬帶絳蟲的150 kD疏水性結合蛋白（HLBP）調節脂肪酸吸收的機制，結果表明HLBP調節宿主脂肪酸的吸收可能是寄生蟲生存的關鍵因素。迄今為止，國內外對有關豆狀囊尾蚴（Cysticercus pisiformis）免疫學診斷方面的研究工作尚少，僅有1992年倪澤成等對其粗提抗原進行研究的初步報道，但粗提抗原在純化方法上的缺陷限制了其推廣應用［7]。

本研究初次以低分子量抗原RS1為靶基因，通過對GenBank中登錄的豬帶科絳蟲RS1基因序列進行比對，選擇保守區設計引物，進行RT-PCR，克隆到具有完整開放閱讀框（ORF）的cDNA分子RS1，旨在通過對目的基因及其編碼的蛋白結構和特征進行全面的生物信息學分析，為該基因的克隆表達及免疫學特性的初步研究提供理論依據，從而為其生物學功能研究及在免疫診斷與疫苗方面的應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 蟲株與菌株 豆狀囊尾蚴采自人工感染兔的大網膜等處；無菌生理鹽水沖洗3-4次，-70℃保存備用。E. coliJM109由本實驗室保存。pMD18-T克隆載體購自大連寶生物工程有限公司。

1.1.2 主要試劑 Trizol試劑購自Invitrogen公司；RNA simple Total RNA Kit、TIANgel Midi Purification Kit和質粒小量提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；TaqDNA聚合酶、DL2000 Marker購自北京康潤誠業生物科技有限公司；其他常規試劑為進口或國產分析純產品。

1.2 方法

1.2.1 兔豆狀囊尾蚴TpRS1基因的克隆 根據GenBank中登錄的豬帶絳蟲TSOL RS1基因序列（登錄號DQ8650721），用Oligo軟件設計一對引物，上游引物：5'-ATGCGTGCCTACATTGTGCTT-3'；下游引物：5'-GCATGAAAGTTGACAAGTTAAGCAG-3'，引物由上海生工生物工程有限公司合成。按照Trizol試劑說明抽提兔豆狀囊尾蚴總RNA。將提取的總RNA按照RNA simple Total RNA Kit說明合成cDNA，用上下游引物進行PCR擴增。反應程序為：94℃ 4 min；94℃ 30 s，50℃ 30 s，72℃ 45 s，35個循環；72℃10 min。取5 μL PCR產物，于1.5%瓊脂糖凝膠中電泳，檢測擴增片段的長度。電泳檢測后目的基因按TIANgel Midi Purification Kit試劑盒操作說明回收純化。將純化后的PCR產物與pMD18-T克隆載體于4℃連接過夜，將連接產物轉化至E. coliJM109感受態細胞中，并涂布于Amp+LB固體平板，37℃培養14-16 h，鑒定為陽性克隆送測序公司測序。

1.2.2 兔豆狀囊尾蚴TpRS1基因的ORF序列分析 在 http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/g orf/gorf.html上利用ORF finder軟件確定兔豆狀囊尾蚴基因TpRS1完整的ORF序列，并推導編碼蛋白的氨基酸序列。

1.2.3 兔豆狀囊尾蚴TpRS1基因的生物信息學分析

1.2.3.1 基本理化性質分析 利用Protparam（http：//expasy.org/tools/protparam.html）計算蛋白質的理論分子質量、理論等電點、氨基酸組成等。利用ProtScale（http：//expasy.org/tools/protscale.html）分析蛋白質親、疏水性。

1.2.3.2 信號肽和跨膜區分析 利用SignalP3.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）預測蛋白質的信號肽位點。應用TMHMM Serverv.2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）在線分析程序預測跨膜區域。

1.2.3.3 二級結構和功能預測 應用Predictprotein（http：//www.predictprotein.org）對蛋白二級結構及抗原表位作進一步分析。應用MotifScan（http：//hits.isb-sib.ch/cgi-bin/PFSCAN）預測蛋白糖基化位點。

1.2.3.4 同源性比較及系統進化分析 用BlastP軟件對兔豆狀囊尾蚴TpRS1氨基酸序列與GenBank中其他帶科絳蟲的同源性進行比對。運用MEGA5中的Maximum parsimony（MP）法軟件構建系統進化樹并進行分析。

2 結果

2.1 兔豆狀囊尾蚴TpRS1基因的克隆

以提取的兔豆狀囊尾蚴總RNA為模板進行RTPCR擴增，經1.5%瓊脂糖凝膠電泳觀察，在約250 bp出現特異性條帶（圖1），與理論預測值大小相符。

圖1 PCR產物鑒定

2.2 兔豆狀囊尾蚴TpRS1基因的ORF序列分析

使用NCBI的ORF Finder程序對克隆的兔TpRS1基因序列進行開放性閱讀框分析并推測其氨基酸序列，結果（圖2）顯示，TpRS1含有長度為258 bp的開放閱讀框，含有起始密碼子ATG和終止密碼子TAA，編碼85個氨基酸。

2.3 兔豆狀囊尾蚴TpRS1蛋白的生物信息學分析

2.3.1 理化性質 TpRS1所編碼的85個氨基酸殘基組成的多肽的理論分子質量為9.6 kD，理論等電點為9.07，原子組成是C431H710N110O122S6。該蛋白質由19種氨基酸組成，其中Lys含量最豐富，不含Gln，負電荷殘基（Asp+Glu）12個，正電荷殘基（Arg+Lys）15個。脂肪系數為95.29，在溶液中的不穩定指數（Instability index）為37.58，低于閾值40，表明該蛋白狀態穩定。

2.3.2 TpRS1基因編碼蛋白的疏水性/親水性預測和分析 運用ProtScale工具對兔豆狀囊尾蚴TpRS1基因編碼蛋白進行親水性和疏水性分析。依據氨基酸分值越低親水性越強和分值越高疏水性越強的規律可知：兔豆狀囊尾蚴TpRS1基因編碼蛋白多肽鏈第22位Pro具有最低的分值-1.600和最強的親水性；第87位Cys具有最高的分值3.133和最強的疏水性。平均親水性為-0.021，表明該蛋白可能是一個疏水性蛋白（圖3）。該結果與DNASTAR軟件分析結果基本一致。

圖3 TpRS1基因編碼蛋白疏水性分析

2.3.3 信號肽和跨膜區分析 用SignalP 3.0對TpRS1基因編碼蛋白進行信號肽分析，結果表明該蛋白不存在信號肽，不屬于分泌蛋白。用TMHMM2.0分析跨膜結構發現此編碼蛋白所有氨基酸部分位于膜表面，部分位于膜內（圖4），證實TpRS1基因編碼蛋白是一種跨膜蛋白。

圖4 TpRS1基因編碼蛋白的信號肽分析

2.3.4 二級結構及其蛋白功能的預測 預測結果（圖5）顯示，該蛋白的二級結構中α螺旋占70.59%，β折疊占5.88%，其余23.53%為無規卷曲，屬于混合型二級結構。該蛋白基序無N-糖基化位點。抗原位點預測顯示，其氨基酸序列的2、44、45、66、72和76位為抗原表位（圖6）。

圖5 TpRS1二級結構的模擬圖

2.3.5 TpRS1蛋白的同源性比對及系統進化分析 在GenBank進行Blast查詢發現，TpRS1為尚未報道的新序列。通過與GenBank中登錄的其他帶科絳蟲的氨基酸序列進行同源性分析顯示，TpRS1編碼的氨基酸序列與泡狀帶絳蟲（ACI42356）的氨基酸序列相似性最高達到77%；與豬帶絳蟲（AEP03198）、多 頭帶絳蟲（ACI42323）及細粒棘球蚴（AC132106）的序列相似性都為72%（圖7）。

圖6 TpRS1抗原位點的預測

圖7 TpRS1推測的氨基酸序列與其他帶科絳蟲的同源性分析

根據BLAST比對結果，以細粒棘球蚴作為外群，選取部分絳蟲的氨基酸序列構建系統進化樹，TpRS1與泡狀帶絳蟲氨基酸序列同源性最高（圖8）。

3 討論

豆狀囊尾蚴病作為家兔的一種重要的寄生蟲病，國內廣泛流行，但相關研究尚少。目前，主要根據流行病學、臨床癥狀及實驗室檢查等方面對豆狀囊尾蚴病進行綜合診斷［15]。免疫學診斷方面的研究并不多。免疫診斷依賴于高特異性的抗原。本試驗選取低分子量抗原基因RS1進行克隆，首次克隆兔豆狀囊尾蚴TpRS1基因，并最終成功構建了該基因的重組質粒，為獲得兔豆狀囊尾蚴TpRS1抗原蛋白奠定了基礎。在GenBank進行Blast查詢，發現該基因核苷酸序列的ORF與豬帶絳蟲RS1的相同，均為258 bp，含有起始密碼子和終止密碼子均為ATG和TAA，提示RS1基因可能由同一個祖先基因進化而來。

圖8 MP法構建的TpRS1基因系統進化樹

生物信息學是目前生物學領域發展最為迅速的學科，利用已建立的技術平臺和大量的數據庫體系，可以迅速準確地預測目的基因或蛋白質的特性、定位以及功能等關鍵信息。本試驗從跨膜區分析、親水疏水性分析、信號肽分析、抗原位點及二級結構分析對該蛋白的性質功能作出系統預測，TpRS1編碼的氨基酸序列與泡狀帶絳蟲的氨基酸序列最相似，同源性達77%；與豬帶絳蟲、多頭帶絳蟲及細粒棘球蚴也有很高的同源性，都為72%。且與物種進化的結果相一致，反映了RS1基因編碼產物在不同物種結構上的穩定性對生物體的功能重要性。預測發現其沒有信號肽序列，說明該蛋白可能為包涵體表達蛋白，從而為蛋白質表達后蛋白的獲得部分提供了依據。該蛋白為跨膜蛋白，有一定的跨膜區，這些區段一般會形成α螺旋，穿越細胞膜脂質雙層結構而將該膜蛋白定位于細胞膜上，這與該蛋白二級結構中主要為α螺旋的預測結果一致。在機體內疏水性殘基一般埋在蛋白內部，而親水性殘基位于表面，因此蛋白的親水部位與蛋白的抗原位點有密切的聯系，最高親水性區域常位于抗原決定簇內部或其附近［16]。經親水性與抗原表位的共同分析發現該蛋白可能是一個疏水性蛋白，但有6處抗原位點，由此揭秘出該蛋白具有強大的生物學功能，為進一步對該基因的表達及生物學功能的研究奠定基礎，也為該蛋白的免疫診斷、疫苗方面的研究提供理論依據。

4 結論

本研究成功克隆了兔豆狀囊尾蚴TpRS1基因，該基因序列含有一個由258個核苷酸組成的開放閱讀框，編碼85個氨基酸。利用生物信息學軟件，成功預測并分析了TpRS1基因編碼蛋白的基本理化性質、疏水性、信號肽、二級結構、抗原位點及與其他帶科絳蟲的同源性等。

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