中藥川貝對哮喘模型小鼠血管生成的影響※

李厚忠 張羽飛

中藥川貝對哮喘模型小鼠血管生成的影響※

李厚忠1張羽飛2

目的 確定中藥川貝對哮喘模型小鼠血管生成的作用及機(jī)制。方法建立哮喘模型小鼠并且將小鼠隨機(jī)分為三組，即模型組（OVA致敏的小鼠）、中藥川貝組（中藥川貝治療的小鼠）和PBS組（正常對照組的小鼠），中藥川貝組小鼠分別給予中藥川貝（9.0g/kg）。對模型小鼠的氣道炎癥、血管生成、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）和缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）進(jìn)行研究。結(jié)果與哮喘模型組小鼠相比，中藥川貝組可以改善過敏性氣道炎癥，并顯著減少血管百分比，也降低VEGF和HIF-1α的表達(dá)。血管百分比與VEGF和HIF-1α表達(dá)呈正相關(guān)，同時VEGF和HIF-1α表達(dá)呈正相關(guān)。結(jié)論結(jié)果表明，中藥川貝具有重要的抑制哮喘模型小鼠血管生成作用。中藥川貝通過抑制VEGF和HIF-1α表達(dá)實現(xiàn)抗血管生成活性。

血管生成；哮喘；中藥川貝；血管內(nèi)皮生長因子；缺氧誘導(dǎo)因子-1α

哮喘患者肺組織常伴有新生血管的生成，哮喘患者活組織檢查發(fā)現(xiàn)，不論血管的數(shù)量還是粗細(xì)均有所增加，這些改變可引起氣道阻塞和（或）氣道高反應(yīng)性，從而加重哮喘[1]。目前治療哮喘的一般方法是應(yīng)用糖皮質(zhì)激素、白三烯受體拮抗藥物等[2]，由于不良反應(yīng)嚴(yán)重，患者很難接受，那么尋找安全有效的中藥就顯得更加重要。中藥川貝治療哮喘安全可靠，可作為首選。

以往有研究表明，血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（VEGF）在血管生成過程中起核心作用[3]。近年研究發(fā)現(xiàn)，VEGF調(diào)節(jié)血管生成是通過缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF- 1α）實現(xiàn)的[4]，HIF-1α可以調(diào)節(jié)基因表達(dá)響應(yīng)氧氣濃度的變化。在本研究中建立哮喘小鼠模型，通過檢測氣道炎癥、血管百分比以及血管生成與VEGF和HIF-1α的關(guān)系，主要評價中藥川貝治療哮喘的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試藥中藥川貝粉的制備：選取整齊、粉性足者。由于川貝忌水洗，為去除藥材表面的灰塵，可采用潔凈的紗布擦拭藥材表面。凈選后的川貝通過滅菌消毒窗消毒15min后直接轉(zhuǎn)至粉碎車間，用Fz-400型粉碎機(jī)組加工成100目細(xì)粉，收得細(xì)粉裝入潔凈的容器中，封口。全部加工完后的細(xì)粉用潔凈的塑料袋分裝成1kg/袋備用。

1.2 實驗動物雌性BALB/C小鼠30只，6～8周齡，由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供，實驗動物合格證號為P00102008。

1.3 模型建立健康清潔級 BALB/C小鼠腹腔內(nèi)注射10%卵蛋白+10%氫氧化鋁混合液1m l作為首次致敏，第15天將小鼠依次置于超聲霧化器中，用1%卵蛋白生理鹽水噴霧激發(fā)小鼠哮喘發(fā)作，隔日一次，一次 20m in，共激發(fā) 28d。以小鼠出現(xiàn)口唇發(fā)紺、腹肌痙攣、呼吸加快、點頭呼吸或站立不穩(wěn)等現(xiàn)象表示成功激發(fā)。將成功制備的哮喘模型小鼠（20只）隨機(jī)分為兩組（每組10只）。分別為模型組和中藥川貝組，另設(shè)PBS組（10只以生理鹽水代替卵蛋白進(jìn)行腹腔注射及霧化吸入給藥）。分組后每天灌胃給藥，模型組和PBS組給予等量生理鹽水，中藥川貝組給予川貝粉9.0g/kg，每天1次，連續(xù)28d。最后1次給藥2h后，三組小鼠應(yīng)用1%巴比妥鈉麻醉，取出肺組織保存，待用于組織學(xué)檢測。

1.4 組織學(xué)分析肺組織采用 4%多聚甲醛固定、石蠟包埋、切片、蘇木精和伊紅染色、數(shù)字顯微鏡掃描。根據(jù)組織學(xué)評分系統(tǒng)對支氣管周圍炎癥進(jìn)行評分：①支氣管周圍無炎細(xì)胞；②可見少量炎細(xì)胞；③大量炎細(xì)胞，但未完全浸潤支氣管；④1層炎細(xì)胞完全浸潤支氣管；⑤2層炎細(xì)胞完全浸潤支氣管；⑥3層或更多炎細(xì)胞完全浸潤支氣管。使用所有肺組織的支氣管除以有炎癥的支氣管計算平均支氣管炎癥指數(shù)。

1.5 免疫組化法檢測VEGF和HIF-1α表達(dá)及計算血管百分比肺組織石蠟切片、脫蠟、脫水、浸泡于3% H2O2中15min滅活內(nèi)源性過氧化物酶。置于煮沸檸檬酸鈉中修復(fù)抗原，暴露抗原表位并且用3%小牛血清蛋白阻斷。切片與血管性血友病因子（vWF）初級抗體孵育。VEGF和HIF-1α分別于4℃過夜，隨后與二氨基聯(lián)苯胺孵育。用均勻結(jié)合在內(nèi)皮細(xì)胞表面的 vWF抗體標(biāo)記血管，所有的后續(xù)步驟均在ZSGB-BIO Autostainer進(jìn)行。隨機(jī)選定一個 HPF（200×）視野，像場的總面積除以vWF陽性面積即得血管百分比，免疫組化染色支氣管上皮細(xì)胞用于計算VEGF和HIF-1α表達(dá)。

1.6 Western blotting檢測VEGF和HIF-1α表達(dá)在蛋白酶抑制劑的存在下肺組織勻漿，以獲得肺蛋白提取物，用于Western blotting分析，使用bca-100蛋白定量分析試劑盒確定濃度。每組蛋白質(zhì)等量（30μg）固定SDS聚丙烯酰胺凝膠，然后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，膜在三異丙基乙磺酰緩沖鹽水吐溫20（25mM Tris pH 7.5，150mM NaCl和0.1% Tween 20）中用5%的脫脂奶粉封閉1h，與原發(fā)性抗VEGF抗體或抗-HIF-1抗體4℃過夜孵育，然后與二抗雜交（Dako,1:2000），增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光顯示特異性結(jié)合，以 β-Actin為內(nèi)參，X射線掃描，計算機(jī)輔助雙向光密度計分析光密度，計算VEGF和HIF- 1α表達(dá)的相對比例。

1.7 統(tǒng)計分析計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析和 Mann Whitney檢驗相關(guān)數(shù)據(jù)的分布。VEGF和HIF-1α表達(dá)與血管百分比的相關(guān)性采用Spearman檢驗評價。P＜0.05為具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 中藥川貝改善過敏性氣道炎癥組織學(xué)分析顯示，模型組呈典型哮喘病理特征（圖1A）。許多炎細(xì)胞浸潤支氣管周圍，支氣管上皮增厚，與PBS組比較炎癥指標(biāo)明顯增強(qiáng)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。給予中藥川貝干預(yù)后，氣道炎癥明顯改善，炎細(xì)胞減少，支氣管上皮增厚范圍縮?。▓D1B），與模型組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），見表1。

圖1 小鼠肺組織組織病理學(xué)切片(200×)

表1 三組哮喘模型小鼠血管生成影響的指標(biāo)情況比較[(±s),n=10]

表1 三組哮喘模型小鼠血管生成影響的指標(biāo)情況比較[(±s),n=10]

注：模型組與PBS組比較**P＜0.01；中藥川貝組與模型組比較※※P＜0.01，※P＜0.05

指標(biāo) 模型組 中藥川貝組 PBS組平均炎癥指數(shù) 4.79±0.21※※ 2.91±0.17** 1.60±0.15血管百分比 2.82±0.78※※ 0.77±0.13** 0.42±0.10 VEGF表達(dá) 93.29±1.55※※26.25±1.08** 23.08±2.79 VEGF表達(dá)相對比 2.08±0.30※※ 1.12±0.22** 0.96±0.30 HIF-1α表達(dá) 89.60±0.79※※71.70±1.40** 11.70±0.30 HIF-1α表達(dá)相對比 0.97±0.30※ 0.88±0.47** 0.32±0.12

2.2 中藥川貝降低血管生成OVA致敏后，血管生成（圖2）。模型組血管百分比明顯升高，與PBS組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。給予中藥川貝干預(yù)后，血管百分比明顯降低，與模型組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），見表1。

圖2 小鼠肺組織vWF陽性血管面積(200×)

2.3 中藥川貝降低VEGF表達(dá)模型組支氣管上皮細(xì)胞，肺泡上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞VEGF表達(dá)明顯升高，中藥川貝干預(yù)后，VEGF表達(dá)接近PBS組（圖3，表1）。Western blotting結(jié)果顯示，在模型組VEGF表達(dá)明顯升高，與PBS組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；中藥川貝干預(yù)后，VEGF表達(dá)降低，與PBS組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖4和表1。

圖3 小鼠肺組織VEGF表達(dá)(200×)

圖4 Western blotting結(jié)果

2.4 中藥川貝降低HIF-1α表達(dá)為進(jìn)一步闡明中藥川貝抗血管生成機(jī)制，本實驗還檢測了肺組織HIF-1α表達(dá)水平。PBS組僅可見少量HIF-1α陽性細(xì)胞，而在模型組肺泡上皮細(xì)胞核HIF-1α高表達(dá)（圖4～5）。Western blotting檢測HIF-1α相對比，結(jié)果顯示模型組HIF-1α表達(dá)上調(diào)，與PBS組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；中藥川貝組HIF-1α表達(dá)下調(diào)，與模型組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，表1）。

圖5 小鼠肺組織HIF-1α表達(dá)(400×)

2.5 血管百分比與VEGF和HIF-1α表達(dá)相關(guān)性 Western blotting結(jié)果顯示（圖4），血管百分比與VEGF（r = 0.693，P＜0.01）和HIF-1α（r = 0.785，P＜0.01）表達(dá)程正相關(guān)，因此VEGF和HIF-1α表達(dá)呈正相關(guān)（r = 0.641，P＜0.05)。

3 討論

為闡明中藥川貝抗血管形成機(jī)制，本研究檢測了平均炎細(xì)胞指數(shù)和血管百分比。哮喘模型小鼠肺組織可見大量炎細(xì)胞浸潤支氣管周圍，同時支氣管上皮細(xì)胞損傷，炎癥是哮喘加重的一個重要因素[5]。炎癥效應(yīng)細(xì)胞（肥大細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等）是血管形成的主要誘因，這與哮喘患者血管生成增多相一致[6-8]，哮喘模型小鼠血管百分比明顯增加。本研究發(fā)現(xiàn)，中藥川貝不僅可以改善氣道炎癥，而且還可以減少血管生成，結(jié)果證實中藥川貝具有抗血管生成作用。

本研究證實了VEGF和HIF-1α表達(dá)的關(guān)系。近年研究表明，VEGF的激活受HIF-1α調(diào)控，哮喘發(fā)作時HIF-1α表達(dá)增加，從而使VEGF表達(dá)上調(diào)，最終引起血管生成增加，這與文獻(xiàn)結(jié)果相一致。

在哮喘模型小鼠還發(fā)現(xiàn)支氣管上皮細(xì)胞，肺泡內(nèi)皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞VEGF表達(dá)增加，此結(jié)果明確了VEGF表達(dá)和血管百分比之間的關(guān)系。眾所周知，在血管生成過程中，VEGF起核心作用[9]。中藥川貝降低降低VEGF表達(dá)，抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖和血管生成，最終降低血管百分比，VEGF表達(dá)降低可能是中藥川貝抗血管生成的機(jī)制之一。

終上所述，中藥川貝可以減輕氣道炎癥，降低VEGF和HIF-1α表達(dá)，從而抑制哮喘模型小鼠肺組織血管生成，本研究支持中藥川貝支持治療人類哮喘的良好作用。

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The Effects of Bulbus Fritillariae Cirrhosae on Angiogenesis in a M urine Asthma model

Li Houzhong Zhang Yufei

Ob jec tive The aim of this study is to determ ine the effects and mechanism s of Bulbus Fritillariae Cirrhosae on angiogenesis in a murine asthma mode l.MethodsA m ouse m odel o f asthm a was estab lished and the m ice were random ly divided into three groups,nam ely the m odel group (OVA sensitized m ice),Chinese m edicine group (TCM Chuanbei Chuanbei treated m ice) and group PBS (norm al control group m ice),Chinese m edicine fritillary bu lb group m ice were given traditiona l Chinese m edicine Fritillary (9.0g/kg). Airway inflamm ation, blood vessel formation,vascular endothelial grow th factor on model m ice (VEGF) and hypoxia inducible factor -1α (HIF-1α) stud.Resu ltsAdm inistration o f Bu lbus Fritillariae Cirrhosae am eliorated allergic airway inflamm ation and significantly reduced the percentage vascu larity com pared w ith those in the asthm atic mode l m ice.It a lso reduced the expression of HIF-1α,as we ll as that o f VEGF.Percentage vascularity had positive corre lation w ith both HIF-1α and VEGF expression.Furtherm ore,there is positive re lationship between HIF-1α and VEGF exp ression.Conc lusionThe results demonstrate that Bulbus Fritillariae Cirrhosae has an im portant inhibitoryeffect on angiogenesis in asthma. Inhaled adm inistration o f Bulbus Fritillariae Cirrhosae achieved anti-angiogenic activity through inhibition of HIF-1α and VEGF expression.

Angiogenesis;Bu lbus Fritillariae Cirrhosae;Asthm a;VEGF;HIF-1α

R285.5

A

1673-5846(2014)05-0193-03

1牡丹江醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，黑龍江牡丹江 157011

2牡丹江醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥研究中心，黑龍江牡丹江 157011

牡丹江醫(yī)學(xué)院科學(xué)技術(shù)研究項目（編號：2010-34）

李厚忠（1979-），黑龍江省哈爾濱市呼蘭區(qū)人，碩士，主要從事藥理學(xué)和毒理學(xué)研究。

張羽飛（1981-），碩士，主要從事男性生殖研究工作。E-mail：yufeizhang@foxmail.com。