鹽酸左氧氟沙星片微生物限度檢測的方法學建立和驗證

李趣嫦 朱歡敏 肖建光

鹽酸左氧氟沙星片微生物限度檢測的方法學建立和驗證

李趣嫦 朱歡敏 肖建光

目的 建立了鹽酸左氧氟沙星片微生物限度的檢測方法，并對方法學進行驗證。方法采用低速離心結合薄膜過濾手段建立鹽酸左氧氟沙星片的微生物限度檢測方法。結果細菌計數及控制菌用薄膜過濾法檢查，霉菌及酵母菌計數用常規法檢查。結論該方法準確、可靠，適用于左氧氟沙星片的微生物檢查。

左氧氟沙星片；微生物限度；方法學；建立；驗證

鹽酸左氧氟沙星片適用于敏感細菌引起的輕、中度感染，主要用于呼吸道系統感染、泌尿系統感染、生殖系統感染、皮膚軟組織感染、腸道感染、敗血癥、粒細胞減少及免疫功能低下患者和各種感染等，有抗菌譜廣、抗菌作用強的特點。本文根據《中國藥典》2010版[1]的要求，建立了鹽酸左氧氟沙星片的微生物限度檢查方法，并對方法學進行了驗證。

1 儀器與試藥

1.1 菌種金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、大腸埃希菌[CMCC(B)44102]、枯草芽孢桿菌[CMCC (B)63501]和白色念珠菌[CMCC(F)10123]均購自中國食品藥品檢定研究院；黑曲霉（ATCC16404）購自于廣東省微生物研究所。

1.2 培養基營養瓊脂培養基，玫瑰紅鈉瓊脂培養基，營養肉湯培養基，改良馬丁培養基，改良馬丁瓊脂培養基，膽鹽乳糖培養基，MUG培養基，曙紅亞甲藍瓊脂培養基。

1.3 供試品鹽酸左氧氟沙星片，批號：20111101、20120101、20120301，規格：0.1g，生產廠家：廣東彼迪藥業有限公司。

2 方法與結果

2.1 菌液的制備

2.1.1 大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌 取新鮮培養物接種至營養肉湯培養基中，置30～35℃培養18～24h；培養物用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1m l含菌數為50～l00cfu的菌懸液。用于控制菌驗證時配制成每1m l含菌數小于l00cfu的菌懸液。

2.1.2 白色念珠菌 取新鮮培養物接種至改良馬丁培養基中，置23～28℃培養24～48h；培養物用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1ml含菌數為50～l00cfu的菌懸液。

2.1.3 黑曲霉 取新鮮培養物接種至改良馬丁瓊脂斜面培養基中，置23～28℃培養5～7d，加入3～5ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。然后，采用適宜的方法吸出孢子懸液至無菌試管內，用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液制成每lml含孢子數50～l00cfu的孢子懸液。

2.2 供試液的制備取樣品10g，加入pH7.0的氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml，用勻漿儀打碎，制成1:10供試液。

2.3 驗證試驗

2.3.1 霉菌及酵母菌計數 取1:10供試液1ml和試驗菌液1ml注入平皿中，立即傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養基，每株試驗菌平行制備2個平皿。試驗獨立進行3次，見表1。可見平皿法3次試驗，兩株菌株的回收率均大于70%，故鹽酸左氧氟沙星片的霉菌和酵母菌計數按平皿法檢查。

表1 霉菌及酵母菌計數回收率測定結果(平皿法)(%)

2.3.2 細菌計數 方法一：取 1:10的供試液，以500r/min離心3min，分別各取上清液1ml，加至含0.1%聚山梨酯80的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液100ml中，搖勻，濾過，用含0.1%聚山梨酯80的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液1000ml沖洗濾膜，每次 100ml。試驗結果：大腸埃希菌菌株的回收率僅為 8%，故此方法并不適合作為細菌計數檢查方法。方法二：取 1:10的供試液，以 500r/min離心3min，取上清液10ml，加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml，混勻，作為1:100的供試液。取1:100供試液1ml，加至45℃ pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液100ml中，搖勻，濾過，用45℃pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液200ml沖洗濾膜，每次100ml。試驗獨立進行3次，由表2可見，薄膜過濾法3次試驗，三株菌株的回收率均大于70%，故鹽酸左氧氟沙星片的細菌計數采用薄膜過濾法檢查。

表2 細菌計數回收率測定結果(方法二)(%)

2.4 控制菌檢查法的驗證方法一：取 1:10的供試液，以500r/min離心3min，取上清液5ml，加至45℃含0.1%聚山梨酯80的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液100ml中，搖勻，過濾，用45℃含0.1%聚山梨酯 80的 pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液1000ml分10次沖洗濾膜，在最后1次沖洗液中加入大腸埃希菌菌液 1ml，濾干，然后取出濾膜，平行做兩份，取膜至800ml膽鹽乳糖培養基中，按大腸埃希菌的檢查法進行驗證。由表3結果可知，本品對大腸埃希菌有較強的抑制作用，此方法不適合該品種的大腸埃希菌檢查。方法二：取1:10的供試液，以 500r/min離心 3min，取上清液 5ml，加入45℃含1%聚山梨酯80的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液500ml中，搖勻，過濾，用45℃含1%聚山梨酯80的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液500ml沖洗濾膜，每次100ml，在最后1次沖洗液中加入大腸埃希菌菌液 1ml，濾干，然后取出濾膜，平行做兩份，取膜至 1000ml的膽鹽乳糖培養基中，按大腸埃希菌的檢查法進行驗證，見表3。

表3 控制菌驗證結果

3 討論

鹽酸左氧氟沙星對大多數腸桿菌科細菌，如大腸埃希菌、沙門氏菌屬、變形桿菌屬等革蘭陰性細菌有較強的抗菌活性，故將大腸埃希菌作為實驗的敏感菌株。在細菌計數驗證中，用1:10供試液，沖洗量為1000ml，大腸埃希菌的驗證回收率無法達到70%以上。根據《中國藥典》2010版[1]二部附錄ⅪⅩP微生物限度檢查法應用指導原則，“進行驗證試驗時，若沒有適宜的方法消除供試品中的抑菌作用而導致微生物回收的失敗，應采用能使微生物生長的更高稀釋級供試液進行方法驗證試驗”。因此本文擬用1:100供試液，用薄膜過濾法進行驗證。

有文獻報道[2]，硫酸錳中Mn2+作為二價金屬離子可以和喹諾酮類抗生素發生絡合反應，生成物無抑菌作用。但實驗過程卻發現硫酸錳會與膽鹽乳糖培養基發生反應，產生渾濁或生成絮狀沉淀的現象，直接降低培養基的營養成份。本文采用薄膜過濾法及培養基稀釋法能很好地消除本品的抑菌性，方法簡便可行，重復性好。

[1] 中華人民共和國國家藥典委員會.中國藥典(二部)[M].北京:中國醫藥科技出版社,2010:附錄ⅩⅠⅩ.

[2] 劉濤,朱斌,韋濤,等.氧氟沙星栓微生物限度檢查方法探討[J].臨床合理用藥,2010,3(20):4-5.

Development and Validation of a M icrobial Lim it test M ethod for Levofloxacin Hydrochloride tablets

Li Quchang Zhu Huanm in Xiao Jianguang

Ob jec tiveTo deve lop and va lidate a m ethod for m icrobial lim it detection o f levofloxacin hydrochloride tablets.MethodsLow-speed centrifugation and m em brane filtration app roaches were used for the development o f m icrobial lim it detection method for levofloxacin hydrochloride tablets.Resu ltsThe bacteriad and the control of bacteria were determ ined by m embrane filtration app roach,m o lds and yeast were determ ined by routine app roach.Conc lusionThe method is accurate,re liab le,and suitab le for detection of the m icrobia l lim it of levo floxacin hydrochloride tablets.

Levo floxacin tablets;M icrobia l lim it detection;Method;Developm ent;Va lidation

R927.11

A

1673-5846(2014)05-0016-02

廣東省食品藥品檢驗所微生物室，廣東廣州 510180

李趣嫦（1982 -），學士，主管藥師。研究方向：藥物分析。E-mail：liquchang@sohu.com。