鬼箭羽水溶成分抑制氧化型低密度蛋白誘導的THP-1 源性巨噬細胞炎癥因子表達

黃靚 熊文昊 王漢群 鄒飛燕 唐志晗 張弛

鬼箭羽水溶成分抑制氧化型低密度蛋白誘導的THP-1 源性巨噬細胞炎癥因子表達

黃靚 熊文昊 王漢群 鄒飛燕 唐志晗 張弛

目的 探討鬼箭羽水溶成分對氧化型低密度脂蛋白 (ox-LDL)誘導的 THP-1 源性巨噬細胞炎癥因子表達的影響。方法 將 THP-1 源性巨噬細胞分為五個組 , 即對照組、ox-LDL 組、鬼箭羽 1 組、鬼箭羽 2 組、鬼箭羽 3 組。MTT (噻唑藍 )比色法檢測 THP-1 細胞活力 , 酶聯免疫吸附法 (ELISA)檢測細胞上清液中腫瘤壞死因子 α(TNF-α)、白細胞介素 6(IL-6)的含量。結果 鬼箭羽能明顯改善 ox-LDL 作用下 THP-1 源性巨噬細胞的細胞活力 , 抑制 ox-LDL 誘導的細胞炎癥因子分泌 , 并且呈現濃度依賴性 , 差異有統計學意義 (P＜0.05)。結論 鬼箭羽水溶成分抑制氧化型低密度脂蛋白誘導的 THP-1 源性巨噬細胞炎癥因子表達有關。

鬼箭羽 ；氧化型低密度脂蛋白 ；THP-1 源性巨噬細胞 ； 細胞活力 ；炎癥因子

近年來的研究發現 , 動脈粥樣硬化斑塊中不僅有脂質沉積 , 還有大量的炎癥細胞浸潤 , 這說明炎癥在動脈粥樣硬化的發生、發展過程中起著重要作用。泡沫細胞的形成是動脈硬化早期主要的病理特征 , 氧化型低密度脂蛋白 (oxidized LDL, ox-LDL)對泡沫細胞的形成發揮著舉足輕重的作用。血液中的單核細胞在內膜下轉化為巨噬細胞 , 繼而通過 A 型清道受體不斷吞噬大量 ox-LDL, 導致細胞內脂質堆積 ,最終形成泡沫細胞。鬼箭羽是一種主產于我國北部的中藥材 , 它是衛矛科植物衛矛的具有翅狀物的枝條或翅狀附屬物 , 其功效在《本經》的載述主要是破血、止痛、通經、瀉下、殺蟲等；最近的研究表明 , 鬼箭羽具有降低血糖、調節血脂、以及抗動脈粥樣硬化等作用。

1 材料與方法

1. 1 藥物與試劑 鬼箭羽藥材購自衡陽市藥材公司 , 經專家鑒定為衛矛科植物的嫩枝和翅狀附屬物。取鬼箭羽藥材500 g加 6倍水 , 2 h/次 , 煎煮 2次 , 濃縮至 3.0 g/ml生藥 , 浸膏待用 ；THP-1細胞購自中國科學院上海生物化學與細胞生 物學研究所 細 胞中心 ；RPMI-1640培養基購自 Gibco公司 ；佛波酯購自 sigma公司 ；TNF-α 酶聯免疫吸附試劑盒、IL-6酶聯免疫吸附試劑盒均購自美國 R&D公司。

1. 2 脂蛋白的分離、氧化修飾及鑒定 健康人血漿購自衡陽市中心血站 , 采用超速離心法制備低密度脂蛋 (LDL), 然后用 含 10 μmol/L CuSO4 的 PBS溶 液 將 LDL氧化修 飾 成 ox-LDL, 4℃ 保存。

1. 3 細胞培養及分組 THP-1細胞用含有 10% 小牛血清RPMI 1640培養液 , 在 37℃、5%CO2培養箱中靜置培 養。培養基中加 HEPES 10 mmol/L, 在每次實驗前用 160 nmol/L佛波酯處理 24 h, 使其誘導分化成巨噬細胞。實驗共分五組 ：①對照組 , 不加 ox-LDL處理 ；② ox-LDL組 50 mg/L ox-LDL處理 24 h組 ；③鬼箭羽 1組 ：3 μg/ml 鬼箭羽和 50 mg/L ox-LDL共處理 24 h組 ；④鬼箭羽 2組 ：10 μg/ml 鬼箭羽和 50 mg/L ox-LDL共處理 24 h組 ；⑤鬼箭羽 3組 ：30 μg/ml 鬼箭羽和50 mg/L ox-LDL共處理 24 h組。

1. 4 統計學方法 采用 SPSS15.0統計軟件對該研究的數據進行統計學的分析 , 計量資料以均數 ± 標準差 ( x-±s)表示 ,組間比較采用方差分析和 t檢驗 , P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2 .1 不同濃度鬼箭羽對 ox-LDL作用下 THP-1巨噬細胞活力的影響 ,見表1。

與對照組比較 , ox-LDL 組細胞活力明顯受損 (P＜0.01),不同濃度鬼箭羽組細胞活力較 ox-LDL 組有不同程度的增強 ,且呈現濃度依賴性。

2. 2 鬼箭羽對 ox-LDL 作用下 THP-1 巨噬細胞炎癥因子分泌的影響

圖 1 鬼箭羽減少 ox-LDL所致的 THP-1細胞 TNF-α 的釋放

圖 2 鬼箭羽減少 ox-LDL所致的 THP-1細胞 IL-6的釋放

THP-1 細胞經 50 mg/L ox-LDL 處理 2 h 后 , 細胞培養上清液中的 TNF-α、IL-6 濃度增加 , 與對照組比較差異有統計 學 意 義 (P＜0.05), 而 ox-LDL+ 不 同 濃 度 (3、10、30 μg/ml)的鬼箭羽處理 2 h 后 , TNF-α、IL-6 濃度顯著降低 , 與 ox-LDL 組比較差異均有統計學意義 (P＜0.05), 且呈現出濃度依賴性。

3 討論

動脈硬化是一種炎癥性疾病 , 炎癥反應貫穿了動脈硬化發生發展的全過程 , 大量的炎癥因子參與到這個過程中 , 對動脈硬化的形成與發展發揮了重要的作用。TNF-α 是一種由單核細胞分泌的炎癥與免疫調節因子 , 在 AS 病變中的表達明顯增高 , 提示其與 AS 及 CHD 的發生、發展密切相關。IL-6 是一種多功能的前炎癥因子 , 能加速肝臟合成 C- 反應蛋白 , 促使血管內皮細胞的活化和血管平滑肌細胞的增生。IL-6 可促進血管內皮細胞粘附分子的表達與釋放 , 促使巨噬細胞對 LDL 的攝取 , 促進動脈硬化的形成［1］。

鬼箭羽以衛矛之名始載于《神農本草經》, 現有的研究證明 , 鬼箭羽提取物主要通過降低急性缺血模型大鼠血清 CK、CK-MB、AST、LDH 和 MDA 水 平 , 提 高 大 鼠 血 清SOD、NO 含量來改善心肌細胞耐缺氧的能力 , 從而發揮防治心肌缺血的作用；另外鬼箭羽的提取物能夠顯著降低糖尿病小鼠的空腹血糖 , 從而改善糖尿病小鼠由于血糖增高所引起的糖代謝紊亂。韓國學者研究報道 , 鬼箭羽通過抑制 IKKβ來減弱 LPS 誘導的 RAW264.7 細胞 NF-κB 的活化 , 從而抑制 iNOS 的表達和 NO 的產生 , 發揮抗炎的作用。鬼箭羽的提取物還具有清除活性氧自由基的作用 , 可防止生物膜的脂質過氧化。在本研究中 , 首次發現鬼箭羽能夠顯著降低 50 mg/L ox-LDL 誘發的 THP-1 源性巨噬細胞 TNF-α、IL-6 的釋放 ,并提高 ox-LDL 誘導的 THP-1 源性巨噬細胞細胞活力 , 呈現濃度依賴性 , 結果提示鬼箭羽可能通過抑制炎癥因子的釋放來發揮抗動脈粥樣硬化的作用。至于鬼箭羽究竟通過何種信號通路發揮其抗炎作用 , 以及鬼箭羽對于巨噬細胞膽固醇轉運的影響 , 作者將在后續的試驗中繼續研究。

［1］黃德斌 ,余昭芬 .鬼箭羽三種提取物對氧自由基作用的影響 .湖北民族學院學報 , 2006,23(2):4-6.

2014-04-08］

421001 湖南衡陽 , 南華大學心血管病研究所 (黃靚 唐志晗 )；外科學總論教研室 (黃靚 熊文昊 王漢群 鄒飛燕 唐志晗 )；機能學實驗中心 (張弛 )