清熱排毒膠囊對急性痛風大鼠模型IL-1β、IL-8和TNF-α的影響

王苗慧，馬鴻斌，孫紅旭，楊雪芳，常建全

（1.甘肅中醫學院2011級碩士研究生，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅中醫學院附屬醫院，甘肅 蘭州 730020）

痛風（Gout）是由于嘌呤代謝紊亂和（或）尿酸排泄障礙所引起的血尿酸增高的代謝性疾病，急性痛風性關節炎（acute gouty arthritis）是其最常見的首發癥狀。近年來，研究認為痛風性關節炎的發生發展過程與IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α等細胞因子有關［1］。導師馬鴻斌教授臨床應用清熱排毒膠囊治療急性痛風性關節炎取得滿意效果。我們通過檢測急性痛風模型大鼠踝關節浸出液中炎性細胞因子IL-1β、IL-8和TNF-α的含量，探討清熱排毒膠囊防治急性痛風性關節炎的部分作用機理，總結如下。

1 實驗材料

實驗動物：健康SPF級SD雄性大鼠60只，體質量（200±20）g，購自甘肅中醫學院SPF實驗中心，實驗動物質量合格證號SCXK（甘）2011-0001-0001221。實驗期間大鼠自由攝食和飲水。

藥品與試劑：清熱排毒膠囊（土茯苓、秦艽、萆薢、薏苡仁、延胡索、沒藥、三七、黃芪等），由甘肅中醫學院附屬醫院制劑科制成生藥膠囊，每粒0.45g，批號121022；雙氯芬酸鈉雙釋放腸溶膠囊（戴芬），TemmLer Werke GmbH生產，每片75mg，批號104166；尿酸鈉（MSU），SIGMA公司，每瓶5g，批號10010995；IL-1β、IL-8和TNF-α ELISA試劑盒，購自上海麗臣商貿有限公司，批號CK-E30419，CKE30583，CK-E30635。

實驗儀器：游標卡尺（上海申韓量具有限公司），BP210S 電子分析天平（Sartorius公司提供），SHZ-82水浴恒溫振蕩器（金壇市恒豐儀器廠），10～500μL微量移液器（上海求精生化試劑儀器有限公司），酶聯免疫檢測儀（Benchmark Plus，美國BIO-RAD）。其余相關設備由甘肅中醫學院科研實驗中心提供。

2 實驗方法

分組與給藥：選用健康SPF級SD雄性大鼠60只，適應性喂養1周，稱重，之后采用隨機數字表法隨機分為空白組、模型組、雙氯芬酸鈉緩釋片組（戴芬組）、清熱排毒膠囊高、中、低劑量組，每組10只。根據人與動物及各類動物間藥物劑量的換算方法，清熱排毒膠囊高、中、低劑量組的給藥劑量分別為1g/kg、0.5g/kg、0.25g/kg，戴芬組給藥劑量為6.8mg/kg，溶于蒸餾水配制成相應濃度的灌胃藥液。空白組、模型組給予相應體積的蒸餾水。灌胃按1mL/100g計算，以上各組每天灌胃給藥1次，連續給藥7天。

造模方法：取500mg尿酸鈉晶體（MSU）加入25mL 0.9%氯化鈉注射液，攪拌制成濃度為20mg/mL的尿酸鈉溶液。采用改良后的Coderre大鼠動物模型造模方法［2，3］。第5天灌胃給藥1h后，選受試大鼠右側踝關節背側，常規碘伏消毒后，用6號注射針與脛骨成45℃方向插入踝關節，將100μL尿酸鈉溶液注入到踝關節腔，以關節囊對側鼓起為注入標準，即成大鼠急性痛風性關節炎模型。空白組用等體積生理鹽水溶液關節腔注射。

取材方法：造模48h后將所有實驗動物用過量水合氯醛（350mg/kg）腹腔注射麻醉處死，剪取右側踝關節（關節近端及遠端各保留約0.5cm），去皮，剪開關節周圍組織，將組織浸泡于盛有3mL生理鹽水的離心管中，恒溫震蕩10min后再浸泡1h，4℃低溫離心（12000rpm，10min），取上清液分裝于EP管中，-80℃低溫冰箱凍存待測相關指標。

3 觀察方法

觀測指標：觀察各組大鼠造模前后關節皮色、皮溫、腫脹等一般情況。大鼠踝關節腫脹度測定方法為實驗前在每只大鼠右側踝關節處用記號筆作一清晰標記，通過2～3mm寬紙條和游標卡尺測量造模前、后不同時間段的踝關節周徑，計算出踝關節腫脹度=（測定時間點關節周徑－初始周徑）/初始周徑。采用 ELISA 法檢測大鼠踝關節浸出液中IL-1β、IL-8和TNF-α的含量，具體操作步驟按試劑盒說明書進行。

4 實驗結果

一般情況。各組大鼠造模前精神狀態佳、活潑好動，造模后大鼠右踝關節明顯紅腫、灼熱、倦怠懶動、攝食量明顯減少。空白組關節與造模前相比略增粗，無明顯紅腫及活動受限的表現。模型組關節紅腫、灼熱較藥物治療組明顯，說明各藥物治療組預防性給藥有效。

各組大鼠踝關節腫脹度見表1。

表1 各組大鼠踝關節腫脹度比較 （%，）

表1 各組大鼠踝關節腫脹度比較 （%，）

注：與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01；與戴芬組比較，*P<0.05，**P<0.01。

組別 6h 8h 10h 12h 24h 48h空白組 0.133±0.033##** 0.126±0.032##** 0.112±0.032##** 0.103±0.029##** 0.083±0.020##** 0.043±0.007##**模型組 0.399±0.044** 0.500±0.019** 0.477±0.023** 0.439±0.043** 0.398±0.024** 0.350±0.021**戴芬組 0.260±0.036## 0.300±0.033## 0.274±0.034## 0.247±0.036## 0.207±0.030## 0.155±0.017##清熱排毒高劑量組 0.337±0.019##** 0.373±0.015##** 0.351±0.018##** 0.340±0.014##** 0.300±0.019##** 0.248±0.014##**清熱排毒中劑量組 0.330±0.027##** 0.358±0.018##** 0.345±0.025##** 0.327±0.017##** 0.290±0.020##** 0.231±0.017##**清熱排毒低劑量組 0.350±0.048##** 0.384±0.019##** 0.359±0.023##** 0.345±0.026##** 0.305±0.022##** 0.261±0.013##**

各組大鼠踝關節浸出液中IL-1β、IL-8和TNF-α含量見表2。

表2 各組大鼠踝關節浸出液中IL-1β、IL-8和TNF-α含量 （pg/mL，）

表2 各組大鼠踝關節浸出液中IL-1β、IL-8和TNF-α含量 （pg/mL，）

注：與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01；與戴芬組比較，*P<0.05，**P<0.01；與清熱排毒中劑量組比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01。

組別 劑量 IL-1β IL-8 TNF-α空白組 - 3.88±0.36## 29.60±3.66## 3.10±0.51##模型組 - 4.90±0.46**▲ 37.90±4.76**▲ 4.25±0.46▲**戴芬組 6.8mg·kg-1 4.00±0.37## 31.44±2.54## 3.21±0.42##清熱排毒高劑量組 1g·kg-1 4.30±0.39## 33.20±2.48# 3.59±0.60##清熱排毒中劑量組 0.5g·kg-1 4.21±0.52## 32.67±3.65## 3.33±0.36##清熱排毒低劑量組 0.25mg·kg-1 4.44±0.50# 34.07±4.45# 3.73±0.56#*

5 討 論

急性痛風性關節炎屬中醫 “痹證”、“歷節病”、“白虎歷節”范疇。元代朱丹溪所著《格致余論·痛風論》中明確提出痛風的病機理論為“熱血得寒，污濁凝澀，所以作痛”，說明痛風的發生是由于一種病理產物阻遏脈道，影響氣血正常運行，不通則痛。馬鴻斌教授認為本病的發生多由先天正氣不足或勞倦過度，風、寒、濕、熱之邪侵襲人體，痹阻關節經絡，以致經絡阻滯，氣血運行不暢而致。初起屬實證，多為濕熱痹阻、氣滯血瘀。清熱排毒膠囊有利濕清熱、活血消腫功效。方中萆薢性平味苦，能祛風除濕、通絡止痛；土茯苓“利濕去熱，能入絡，搜剔濕熱之蘊毒”（《本草正義》），用于肢體拘攣、關節不利等癥共為君藥。延胡索辛散溫通，為活血行氣止痛之良藥。沒藥活血化瘀止痛共為臣藥。使以三七味甘微苦性溫，活血化瘀而消腫定痛。秦艽、薏苡仁等加強清熱利濕之力。使以黃芪益氣健脾以防諸藥傷正。甘草調和諸藥。諸藥合用，共奏補肝腎、益氣血、利濕濁之功。實驗結果顯示，造模后大鼠踝關節明顯紅腫、灼熱、活動受限，造模48h后清熱排毒膠囊中劑量組大鼠踝關節腫脹度與戴芬組相當，提示清熱排毒膠囊能夠降低急性痛風性關節炎大鼠踝關節腫脹度，具有抗炎消腫的作用。

現代醫學認為，急性痛風性關節炎是體內長期嘌呤代謝紊亂導致血尿酸升高，當超過了尿酸溶解度，尿酸鈉微晶體即可沉積在關節滑膜及其周圍組織上，刺激關節滑膜，發生滑膜局部血管擴張、通透性增加、白細胞聚集等炎癥反應，進而出現急性痛風性關節炎［4］。諸多研究表明，IL-1β、IL-8和TNF-α作為炎癥趨化因子和激活因子在痛風性關節炎的發生、發展過程中發揮著重要作用，認為IL-1β、TNF-α是前炎癥網鏈中的一級細胞因子，而IL-8是由IL-1β、TNF-α誘導的二級前炎癥細胞因子［5］。用尿酸鈉誘導急性痛風性關節炎大鼠模型48h后，模型組踝關節浸出液中IL-1β、IL-8和TNF-α均有較高水平的表達，表明這些炎性細胞因子參與了痛風的發病過程。實驗研究顯示，清熱排毒膠囊中劑量組對大鼠急性痛風性關節炎模型大鼠踝關節浸出液中IL-1β、IL-8和TNF-α的表達有明顯抑制作用，可達到與戴芬相似的炎癥抑制作用，由此推測清熱排毒膠囊對急性痛風性關節炎具有一定的治療作用，其發揮抗炎作用機制可能與抑制滑膜組織中IL-1β、IL-8和TNF-α的表達有關，但其具體作用機制尚待進一步研究。

［1］Chapman PT，Yarwood H，Harrison AA，et al.Endothelial activation in monosodium urate monohydrate crystal-induced inflammation：in vitro and in vivo studies on the roles of tumor necrosis factor alpha and interleukin-1［J］.Arthritis Rheum，1997，40（5）：955-965.

［2］Coderre TJ，Wall PD.Ankle joint urate arthritis in rats：an alternative animal model of arthritis to that produced by Freund’s adjuvant［J］.Pain，1987，28（3）：379-393.

［3］Coderre TJ，Wall PD.Ankle joint urate arthritis in rats provides a useful tool for the evaluation of analgesic and anti-arthritic agents［J］.Pharmacol Biochem Behav，1988，29（3）：461-466.

［4］周莉.痛風的發病機制［J］.醫學綜述，2011，13（21）：28.

［5］Shrestha M，Chiu MJ，Martin RL，et a1.Treatment of acute gouty arthritis with intramuscular ketorolac tromethamine［J］.Am J Emerg Med，1994，12（4）：454-455.