ELISA法檢測水產品中硝基呋喃代謝物殘留見解

梁娟+于盟盟+韓梅+魏海英+孟霞

DOI:10.3969/j.issn.1004-6755.2014.04.019

硝基呋喃類抗菌劑（Nitrofurans）是一種廣效性抗生素，對大多數革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌、某些真菌和原蟲均有作用，因其價格低廉且對動物性傳染病的預防與治療具有良好的效果而曾經在養殖業中較為廣泛應用。但是，經研究證明，含有硝基呋喃類抗菌劑及其代謝物的食物被人類長期食用后，有致癌、致畸胎等健康危害，因此已被大多數國家明令禁止在人類可食用的動物源性食品中使用。

硝基呋喃類抗菌劑原型藥在生物體內代謝迅速，無法檢測；而其代謝物呋喃唑酮（Furazolidone）、呋喃咜酮（Furaltadone）、呋喃西林（Nitrofurazone）和呋喃妥因（Nitrofurantoin）能與組織蛋白質緊密結合而相當穩定，故利用其代謝物的檢測可反映硝基呋喃類抗菌劑的殘留狀況。

目前，動物體內硝基呋喃類代謝物殘留的檢測方法主要有液相色譜法、液相色譜—質譜法和液相色譜—串聯質譜法，上述方法雖然靈敏度高、準確性好，常作為藥物殘留檢測的確認方法。然而此類方法對儀器和操作人員要求都較高；每個樣品檢測費用大；前處理過程均需過夜衍生，耗時較長，不能滿足現場抽檢的需求和推廣應用。ELISA技術與上述儀器分析方法相比，具有以下優點：一是樣本前處理過程相對簡單，對儀器和人員要求不是很高，檢測人員經過短期培訓即可上崗；二是樣品整個檢測過程中所用試劑多數為無機試劑，與有機試劑相比，對人體傷害和環境污染威脅小，檢測人員無需特殊防護用具；三是該方法耗時短，檢測過程只需要不到1 h，適于現場檢測和大量樣本篩查；四是檢出限低，靈敏度高，可達到μg/kg或ng/kg水平，符合藥物殘留檢測分析的要求。

基于以上特點，ELISA法已成為目前藥品殘留檢測的有效檢測方法之一。

近幾年來，本中心利用ELISA法承擔上級漁業主管部門下達的水產品國家違禁藥物殘留的篩查任務，篩選出的陽性樣品，分別經山東省水產品質量檢測中心和中國水產科學研究院黃河水產研究所用大型儀器分析方法確證，準確率為100%。在圓滿完成上級漁業主管部門下達的篩選任務的同時，本中心取得了一定的操作經驗，現將經驗小結，與大家共勉。

1 加標回收

樣品在萃取、轉移及凈化處理等過程中，會有基體干擾或待檢成分的損失情況。因此，加標回收率的測定是實驗室內經常用以自控的一種質量控制技術，以驗證檢測結果的準確度。

1.1 樣品空白的選取

樣品空白是指在檢測程序中，使用某個濃度的樣品作為儀器的零基準。樣品空白可以抵消加入測試試劑前由于樣品自身含有待測成分引起的正誤差。空白樣品的選擇對檢測結果的準確性至關重要。

加標回收分空白加標回收和樣品加標回收兩種，幾年來，本中心針對這兩種加標回收做了大量的驗證試驗。結果發現，樣品加標回收，如果待測樣品背景值較高，所得回收率會出現不穩定現象。本中心利用同一樣品對呋喃西林和呋喃咜酮兩個項目同時做加標回收試驗，試驗結果得知，該樣品中呋喃咜酮背景值很低，兩個添加濃度的加標回收率均在80%～110%之間；而呋喃西林項目由于背景值較高，兩個添加濃度的回收率分別為207和81.7，出現不穩定現象。試驗結果如表1所示。

本中心還請教了省級水產品檢測中心等權威檢測機構經驗豐富的專家，得出的結論與本中心所做驗證試驗結果一致。所以本中心一般選擇空白加標回收，所得結果準確率為100%。

表1 同一樣品不同項目的加標回收率試驗結果

試驗

項目 試樣測定值

/μg?kg-1 加標濃度

/μg?kg-1 加標試樣測定

值/μg?kg-1 加標回

收率/%

呋喃咜酮 0.082 0.5 0.548 93.2

1.0 0.974 89.2

呋喃西林 0.242 0.5 1.281 207

1.0 1.059 81.7

1.2 加標試驗應遵循的幾條原則

1.2.1 一致原則 樣品與加標試樣按相同的操作步驟和方法同時測定，保證試驗條件一致。為保證準確度，樣品和加標樣分別進行平行測試，以平均值帶入計算。

1.2.2 可比原則 加標樣中原始樣品的取樣量、稀釋倍數及測試體積，盡可能與測試樣品一致。

一般文獻上要求加標量不宜過大，一般為待測成分含量的0.5～2.0倍，且加標后的總含量不應超過方法的測定上限。要想做到這一點，需要檢測人員正確估量樣品中待測成分的含量，這對于經驗不是很豐富的檢測人員來說難度有點大。本中心一般選取標準曲線范圍的中間濃度做加標濃度。

1.2.3 不變原則 加標物的濃度宜高，加標體積宜小，一般不超過原始試樣體積的1%，保持樣品的基體不變。

1.2.4 適用原則 容易實施，便于回收率的計算。

加標回收率=

（加標式樣測定值-式樣測定值）加標濃度×100%

2 加標回收率的意義

加標回收除了考察待測樣品前處理及上機測試全過程中所測成分的破壞或損失情況，更重要的一點，對于國家食品安全有殘留限量的藥物殘留，需要用加標回收率折算檢測結果，以防止不合格樣品流向市場，給廣大消費者造成傷害。例如，某種獸藥的限量值為1.0 μg/kg，如果某個樣品的檢測結果為0.9 μg/kg，在不做加標回收的情況下可以判定該產品合格。但是，如果做了加標回收，加標回收率為80%，通過檢測結果和回收率折算，該產品的獸藥濃度為1.1 μg/kg，該產品應被判定為不合格。

3 標準曲線的分析利用

目前市面上ELISA試劑盒的價格普遍較高，一般96孔的試劑盒的價格在四五千元左右。進行樣品檢測時，一般要求標準曲線的相關系數達到0.99以上才可以對樣品中待測成分進行準確定量，但有時候難免出現標準曲線系數做的比較低的情況。為了節約試驗經費，我們一般通過對相關系數比較低的曲線各個標準點進行分析。如果一條曲線相關系數的偏離只是因為極個別的標準點，其他的幾個點的線性關系良好，那么，只要是位于這幾個點濃度范圍內的所檢樣品的檢測值是可信的。

4 ELISA方法操作過程中注意事項

4.1 樣品前處理

提取試劑的添加要準確，渦旋混勻的時間要嚴格按照說明書操作，時間過長，容易造成乳化現象和溶解出更多的雜質成分；時間過短，容易造成混合不均勻、提取不充分，造成假陰性。離心轉速或離心力應達到說明書要求，樣品氮吹時，應盡量吹干，不要殘留有機溶劑。去除上層正己烷等脂肪層時，應確保去除干凈，防止對結果造成干擾影響。

4.2 試劑盒保存

試劑盒應當在2～8 ℃的溫度下儲存（試劑盒說明書有特殊規定的，嚴格按照規定的儲存條件執行），不能在過熱或過冷的溫度下放置時間太長。

微孔板應盡量真空、干燥保存以保持更好的穩定性，因此剩余的微孔板要盡快放回密封袋保存；標準物質和無色的顯色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。

4.3 試劑盒平衡

每個試劑盒都有相應的最佳反應溫度，用前一般需在室溫放置20～30 min以上。試劑及樣本沒有回復至室溫20～25 ℃，將導致檢測吸光度值和靈敏度發生變化。冬季室溫低，可將試劑盒置37℃溫箱20 min。如果試劑體積較大則需要回溫時間較長，不能用溫水浴回溫。

4.4 保證標準品與樣品的同步性

為了保證樣品檢測結果的準確可靠，應力求與標準品同步檢測；

加入標準品、樣品、酶結合物應用液、底物應用液以及各種試劑時，為確保時間的一致性，應使用定量多道加液器，且加液過程要迅速完成；

定量多道加液器應定期校準，并且用前檢查吸嘴是否套緊，確保吸液量一致；

從低濃度到高濃度地添加標準品，降低影響標準曲線質量的風險；

一個人操作時，一個項目一次不宜多于兩塊板同時測定。

4.5 避免板內差異性大應注意的問題

加液器有兩檔，為了保證微量加樣的準確性和均勻性，我們一般采取“吸二打一”的手法，即吸液時推到二檔，出液時推到一檔；

加液后若出現氣泡會導致反應液界面有差異，在孵育前一定要將氣泡用槍頭扎破；

加液過程中若有液體濺出，不但對鄰近孔造成污染，而且會流到板底，影響吸光度，從而影響檢測結果的準確性；

加樣應盡量垂直懸空加樣，將所加液體按規定的量加入微孔板的1/3處，避免加在孔壁上部，以保證加樣的準確性。

4.6 試劑盒操作的環境條件

確保在標準室溫20～25 ℃下操作，避免在空調風口或者窗口進行操作，溫度過低，會出現吸光度值偏低的現象；如果在陽光直射下試驗，不但會因為過熱造成試劑蒸發，而且會造成吸光度值偏高等導致試驗結果失準的現象。如果操作臺溫度過低，應鋪墊紙巾或者其他物料。

4.7 樣品和試劑的混勻

稀釋前、后的試劑及樣品在加樣前混合要均勻，否則會出現重復性不好的現象。

4.8 孵育

孵育是ELISA測定中影響測定成敗的關鍵因素之一；

孵育的溫度和時間應按規定力求準確，以免出現吸光度值偏高或偏低的現象，導致試驗結果出現偏差；

孵育過程中，反應板不宜疊放，以保證各孔的溫度都能迅速達到孵育要求；

如果樣品量少，一次測定只用少量微孔板，這種情況下，建議將板孔放在板架中間位置較好，這樣可以很容易地排除“邊緣效應”，以提高測定的重復性。

4.9 洗板

在ELISA分析中的再現性，很大程度上取決于洗板的一致性；

洗板次數以及每次每孔洗液的加入量要規范，以免因洗滌不當而造成吸光度值過高的現象，并且吸液量不要溢出孔外，以免影響吸光度的準確性；

最后一次洗滌后進行下一步操作前，甩去板孔中洗液后，一定要在吸水紙上將板孔拍干，否則可能影響試驗結果；

板孔干燥時間過長，會出現標準曲線相關系數低、重復性不好的現象。所以洗板拍干后應立即進行下一步操作。

4.10 顯色

ELISA法測定中，若出現0濃度標準溶液的吸光度值低于1或高于2.5的情況時，即使標準曲線的相關系數達到要求亦不能采用。為了避免出現這種情況，在定量測定中，顯色時間一般根據試劑盒說明書控制。也可依據經驗，在顯色較深時，適當提前2～3 min終止反應；在顯色較淺時，適當延長2～3 min顯色反應時間。

4.11 假陽性與假陰性的產生原因及處理方法

見表2。

表2 假陽性與假陰性的產生原因及處理方法

問題 原因 解決方法

假陽性

假陰性 水質原因

試驗操作

原因

實驗儀器

原因

衍生化試

劑原因

曲線原因

點復溶液驗證 應確保純水

現制現用

離心不徹底 延長離心時間或

改變轉速

樣本污染 更換樣本

吸取到其他相層 準確吸取相層

乳化未完全處理 70℃水浴處理

未清洗干凈 正確的洗滌器皿

有機試劑干擾 更換試劑

有機試劑變質 更換試劑

曲線不好 保證曲線正常

綜上所述，盡管ELISA測定的操作步驟非常簡單，但有可能會影響測定結果的因素卻較多，分布在測定操作的各步驟之中，本文特對常見問題及原因歸納總結，供同行借鑒。

（收稿日期：2014-01-22）

4.4 保證標準品與樣品的同步性

為了保證樣品檢測結果的準確可靠，應力求與標準品同步檢測；

加入標準品、樣品、酶結合物應用液、底物應用液以及各種試劑時，為確保時間的一致性，應使用定量多道加液器，且加液過程要迅速完成；

定量多道加液器應定期校準，并且用前檢查吸嘴是否套緊，確保吸液量一致；

從低濃度到高濃度地添加標準品，降低影響標準曲線質量的風險；

一個人操作時，一個項目一次不宜多于兩塊板同時測定。

4.5 避免板內差異性大應注意的問題

加液器有兩檔，為了保證微量加樣的準確性和均勻性，我們一般采取“吸二打一”的手法，即吸液時推到二檔，出液時推到一檔；

加液后若出現氣泡會導致反應液界面有差異，在孵育前一定要將氣泡用槍頭扎破；

加液過程中若有液體濺出，不但對鄰近孔造成污染，而且會流到板底，影響吸光度，從而影響檢測結果的準確性；

加樣應盡量垂直懸空加樣，將所加液體按規定的量加入微孔板的1/3處，避免加在孔壁上部，以保證加樣的準確性。

4.6 試劑盒操作的環境條件

確保在標準室溫20～25 ℃下操作，避免在空調風口或者窗口進行操作，溫度過低，會出現吸光度值偏低的現象；如果在陽光直射下試驗，不但會因為過熱造成試劑蒸發，而且會造成吸光度值偏高等導致試驗結果失準的現象。如果操作臺溫度過低，應鋪墊紙巾或者其他物料。

4.7 樣品和試劑的混勻

稀釋前、后的試劑及樣品在加樣前混合要均勻，否則會出現重復性不好的現象。

4.8 孵育

孵育是ELISA測定中影響測定成敗的關鍵因素之一；

孵育的溫度和時間應按規定力求準確，以免出現吸光度值偏高或偏低的現象，導致試驗結果出現偏差；

孵育過程中，反應板不宜疊放，以保證各孔的溫度都能迅速達到孵育要求；

如果樣品量少，一次測定只用少量微孔板，這種情況下，建議將板孔放在板架中間位置較好，這樣可以很容易地排除“邊緣效應”，以提高測定的重復性。

4.9 洗板

在ELISA分析中的再現性，很大程度上取決于洗板的一致性；

洗板次數以及每次每孔洗液的加入量要規范，以免因洗滌不當而造成吸光度值過高的現象，并且吸液量不要溢出孔外，以免影響吸光度的準確性；

最后一次洗滌后進行下一步操作前，甩去板孔中洗液后，一定要在吸水紙上將板孔拍干，否則可能影響試驗結果；

板孔干燥時間過長，會出現標準曲線相關系數低、重復性不好的現象。所以洗板拍干后應立即進行下一步操作。

4.10 顯色

ELISA法測定中，若出現0濃度標準溶液的吸光度值低于1或高于2.5的情況時，即使標準曲線的相關系數達到要求亦不能采用。為了避免出現這種情況，在定量測定中，顯色時間一般根據試劑盒說明書控制。也可依據經驗，在顯色較深時，適當提前2～3 min終止反應；在顯色較淺時，適當延長2～3 min顯色反應時間。

4.11 假陽性與假陰性的產生原因及處理方法

見表2。

表2 假陽性與假陰性的產生原因及處理方法

問題 原因 解決方法

假陽性

假陰性 水質原因

試驗操作

原因

實驗儀器

原因

衍生化試

劑原因

曲線原因

點復溶液驗證 應確保純水

現制現用

離心不徹底 延長離心時間或

改變轉速

樣本污染 更換樣本

吸取到其他相層 準確吸取相層

乳化未完全處理 70℃水浴處理

未清洗干凈 正確的洗滌器皿

有機試劑干擾 更換試劑

有機試劑變質 更換試劑

曲線不好 保證曲線正常

綜上所述，盡管ELISA測定的操作步驟非常簡單，但有可能會影響測定結果的因素卻較多，分布在測定操作的各步驟之中，本文特對常見問題及原因歸納總結，供同行借鑒。

（收稿日期：2014-01-22）

4.4 保證標準品與樣品的同步性

為了保證樣品檢測結果的準確可靠，應力求與標準品同步檢測；

加入標準品、樣品、酶結合物應用液、底物應用液以及各種試劑時，為確保時間的一致性，應使用定量多道加液器，且加液過程要迅速完成；

定量多道加液器應定期校準，并且用前檢查吸嘴是否套緊，確保吸液量一致；

從低濃度到高濃度地添加標準品，降低影響標準曲線質量的風險；

一個人操作時，一個項目一次不宜多于兩塊板同時測定。

4.5 避免板內差異性大應注意的問題

加液器有兩檔，為了保證微量加樣的準確性和均勻性，我們一般采取“吸二打一”的手法，即吸液時推到二檔，出液時推到一檔；

加液后若出現氣泡會導致反應液界面有差異，在孵育前一定要將氣泡用槍頭扎破；

加液過程中若有液體濺出，不但對鄰近孔造成污染，而且會流到板底，影響吸光度，從而影響檢測結果的準確性；

加樣應盡量垂直懸空加樣，將所加液體按規定的量加入微孔板的1/3處，避免加在孔壁上部，以保證加樣的準確性。

4.6 試劑盒操作的環境條件

確保在標準室溫20～25 ℃下操作，避免在空調風口或者窗口進行操作，溫度過低，會出現吸光度值偏低的現象；如果在陽光直射下試驗，不但會因為過熱造成試劑蒸發，而且會造成吸光度值偏高等導致試驗結果失準的現象。如果操作臺溫度過低，應鋪墊紙巾或者其他物料。

4.7 樣品和試劑的混勻

稀釋前、后的試劑及樣品在加樣前混合要均勻，否則會出現重復性不好的現象。

4.8 孵育

孵育是ELISA測定中影響測定成敗的關鍵因素之一；

孵育的溫度和時間應按規定力求準確，以免出現吸光度值偏高或偏低的現象，導致試驗結果出現偏差；

孵育過程中，反應板不宜疊放，以保證各孔的溫度都能迅速達到孵育要求；

如果樣品量少，一次測定只用少量微孔板，這種情況下，建議將板孔放在板架中間位置較好，這樣可以很容易地排除“邊緣效應”，以提高測定的重復性。

4.9 洗板

在ELISA分析中的再現性，很大程度上取決于洗板的一致性；

洗板次數以及每次每孔洗液的加入量要規范，以免因洗滌不當而造成吸光度值過高的現象，并且吸液量不要溢出孔外，以免影響吸光度的準確性；

最后一次洗滌后進行下一步操作前，甩去板孔中洗液后，一定要在吸水紙上將板孔拍干，否則可能影響試驗結果；

板孔干燥時間過長，會出現標準曲線相關系數低、重復性不好的現象。所以洗板拍干后應立即進行下一步操作。

4.10 顯色

ELISA法測定中，若出現0濃度標準溶液的吸光度值低于1或高于2.5的情況時，即使標準曲線的相關系數達到要求亦不能采用。為了避免出現這種情況，在定量測定中，顯色時間一般根據試劑盒說明書控制。也可依據經驗，在顯色較深時，適當提前2～3 min終止反應；在顯色較淺時，適當延長2～3 min顯色反應時間。

4.11 假陽性與假陰性的產生原因及處理方法

見表2。

表2 假陽性與假陰性的產生原因及處理方法

問題 原因 解決方法

假陽性

假陰性 水質原因

試驗操作

原因

實驗儀器

原因

衍生化試

劑原因

曲線原因

點復溶液驗證 應確保純水

現制現用

離心不徹底 延長離心時間或

改變轉速

樣本污染 更換樣本

吸取到其他相層 準確吸取相層

乳化未完全處理 70℃水浴處理

未清洗干凈 正確的洗滌器皿

有機試劑干擾 更換試劑

有機試劑變質 更換試劑

曲線不好 保證曲線正常

綜上所述，盡管ELISA測定的操作步驟非常簡單，但有可能會影響測定結果的因素卻較多，分布在測定操作的各步驟之中，本文特對常見問題及原因歸納總結，供同行借鑒。

（收稿日期：2014-01-22）