超聲輔助酶法制備山杏仁多肽

于國泳,郭鵬,孫登岳,范俊峰*

1.北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,北京100083 2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,山東泰安271018

超聲輔助酶法制備山杏仁多肽

于國泳1,郭鵬2,孫登岳2,范俊峰1*

1.北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,北京100083 2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,山東泰安271018

本研究以山杏仁為原料，研究了蛋白酶種類、超聲功率、超聲時(shí)間、超聲溫度、加酶量、pH值、底物濃度對水解度和多肽得率的影響。結(jié)果表明：超聲功率80 w、超聲時(shí)間180 min、超聲溫度50℃、復(fù)合蛋白酶加量5000 U/g，pH值6.0，底物濃度40 g/L，山杏仁多肽得率達(dá)到最大。該條件下，山杏仁多肽得率為56.68±0.99%。

山杏仁;超聲輔助;蛋白酶;多肽

山杏仁為木本植物山杏（Armeniaca sibirica Lam.）的種子，是具有很高營養(yǎng)價(jià)值的藥食同源性食材[1,2]。目前，山杏仁加工僅是初級加工階段，多用于提杏仁油與苦杏仁甙的生產(chǎn)，其蛋白質(zhì)綜合利用率低，造成巨大浪費(fèi)[3,4]。近年來，肽類物質(zhì)由于具有特殊的營養(yǎng)、良好的加工功能特性及多種生物活性已成為國際研究的熱點(diǎn)。因此，利用山杏仁為原料開發(fā)山杏仁多肽不但改變山杏仁蛋白的加工特性，而且為功能性食品及藥品開發(fā)提供了良好的原料，從而促進(jìn)了山杏仁蛋白深加工業(yè)的發(fā)展。山杏仁蛋白深加工產(chǎn)業(yè)發(fā)展能有效優(yōu)化山杏仁產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)，推動我國山杏產(chǎn)業(yè)及功能食品行業(yè)發(fā)展，具有巨大的社會效益、經(jīng)濟(jì)效益及環(huán)保效益。

化學(xué)水解法、定向合成法、酶水解法及微生物發(fā)酵法是目前獲取生物活性肽的常用方法[5]。化學(xué)水解法因不能進(jìn)行特異水解、工藝控制困難、產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定、營養(yǎng)成分損失大及環(huán)境不友好等原因，不適合于大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)[5,6]。定向合成法在合成過程存在消旋現(xiàn)象，且采用此法很難生產(chǎn)食品級的產(chǎn)品及環(huán)境污染問題[7]。微生物發(fā)酵法生產(chǎn)活性肽雖安全且易操作，但存在生產(chǎn)周期長、目標(biāo)產(chǎn)物分離困難[8]。酶水解法制備生物活性肽具有特異高、生產(chǎn)條件溫和等優(yōu)點(diǎn)，是目前獲得食品級生物活性肽最主要的方法[6,8]。近年來，超聲波技術(shù)在天然產(chǎn)物提取、制備方面已經(jīng)被廣泛應(yīng)用[9]。研究表明，超聲波處理能夠提高改變原料性質(zhì)、提高酶活力、增加蛋白酶切位點(diǎn)、促進(jìn)酶催化反應(yīng)、提高多肽得率[10,11]。目前，未見采用超聲輔助酶法對山杏仁蛋白的酶解工藝的研究。本文對超聲輔助酶法制備山杏仁多肽工藝條件進(jìn)行研究，建立超聲輔助酶法制備山杏仁多肽的技術(shù)參數(shù)，為山杏仁多肽開發(fā)提供理論基礎(chǔ)和實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

山杏仁（Armeniaca mandshurica(Maxim.)Skv），北京市農(nóng)林科學(xué)院林業(yè)果樹研究所提供；木瓜蛋白酶（酶活:2000 U/g），sigma，風(fēng)味蛋白酶（酶活:20000 U/g），復(fù)合蛋白酶（酶活:120000 U/g），上海源葉生物科技有限公司；中性蛋白酶（酶活:60000 U/g），sigma；堿性蛋白酶（酶活:200000 U/g），sigma；其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

KQ-600DB型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；KQ5200E型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司，PB153-S電子天平，METTLER TOLEDO；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州市華普達(dá)教學(xué)儀器有限公司；PHS-3D pH計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司；UV754N紫外分光光度計(jì)，上海奧普勒儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 山杏仁蛋白提取采用顧欣報(bào)道的方法進(jìn)行提取[12]。

1.3.2 山杏仁多肽制備采用分析天平稱取一定數(shù)量上述方法制備蛋白粉，用蒸餾水配置一定濃度山杏仁蛋白粉溶液，用0.5 mol/L的HCl或NaOH調(diào)節(jié)pH值，添加一定量蛋白酶，控溫水解，解熱滅酶，冷卻至室溫，3800 r/min離心20 min，得山杏仁短肽溶液（上清液）。

1.3.3 蛋白酶篩選配置40 g/L的山杏蛋白溶液，用0.5 mol/L的HCl或NaOH調(diào)整5種蛋白酶的最適pH，分別在5種蛋白的最適溫度下，按照加酶量4000 U/g添加5種蛋白酶，酶解過程中不斷加入0.5 mol/L NaOH來控制反應(yīng)體系pH值恒定，酶解3 h，95℃水浴15 min滅酶。以水解度和多肽得率為指標(biāo)，選擇最佳蛋白酶。

1.3.4 試驗(yàn)方案選取山杏仁蛋白酶解因素超聲功率（0、60、80，100、120、240 w）、超聲溫度（40、45、50、55、60℃）、超聲時(shí)間（120、150、180、210、240 min）、加酶量（3500、4000、4500、5000、5500 U/g）、pH值（5.0、5.5、6.0、6.5、7.0）、底物濃度（30、35、40、45、50、55 g/L），分別考察各因素對水解度和多肽得率的影響。

1.3.5 分析方法（1）蛋白質(zhì)測定：采用GB/T 5009.5-2010中的方法;（2）水解度測定：采用甲醛滴

定法[1]；（3）短肽得率測定：采用三氯乙酸（TCA）可溶性氮法[13]。

1.4 數(shù)據(jù)分析處理

每項(xiàng)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)，采用SAS8.0、DPS7.05進(jìn)行數(shù)據(jù)的處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同蛋白酶對水解度和多肽得率的影響

圖1 不同蛋白酶對水解度和多肽得率的影響Fig.1 The effect of ultrasonic power on hydrolysis degree and he extraction rate of polypeptide

圖2 超聲溫度對水解度和多肽得率的影響Fig.2 The effect of ultrasound temperature on hydrolysis degree and the rate of polypeptide yield

按照1.3.3方法進(jìn)行試驗(yàn)，測定山杏仁蛋白水解后的多肽得率及水解度，結(jié)果如圖1。由圖1可以看出，不同蛋白酶對山杏仁蛋白水解度效果不同，多肽得率也存在一定差異。復(fù)合蛋白酶、木瓜蛋白酶的水解度及多肽得率均較高，且二者差異不明顯（P＞0.05）。但木瓜蛋白價(jià)格遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于復(fù)合蛋白酶，因此，本研究選擇復(fù)合蛋白酶進(jìn)一步試驗(yàn)。

2.2 超聲功率對水解度和多肽得率的影響

設(shè)定超聲溫度45℃、超聲時(shí)間150 min、加酶量4000 U/g、pH值6.0、底物濃度40 g/L，研究不同超聲時(shí)間（0、60、80，100、120、240 w）對水解度和多肽得率的影響，結(jié)果見表1。

表1 超聲功率對水解度和多肽得率的影響Table 1 The effect of ultrasonic power on hydrolysis degree and the rate of polypeptide yield

由表1可知，隨著超聲功率的升高，山杏仁水解度及多肽得率均呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢。60 w與未經(jīng)超聲處理處理相比差異顯著（P＜0.05），80 w處理與100 w處理差異不明（P＞0.05），與120 w處理差異明顯（P＜0.05）。因此，超聲功率過大，反而會導(dǎo)致水解度及多肽得率下降。故最佳超聲功率為80 w。

2.3 超聲溫度對水解度和多肽得率的影響

固定其他因素不變，超聲功率為80 w，研究不同超聲溫度（40、45、50、55、60℃）對水解度和多肽得率的影響，結(jié)果見圖2。

圖2可以看出，隨著超聲溫度的提高，水解度及多肽得率呈現(xiàn)升高趨勢，當(dāng)超聲溫度超過50℃后，超聲溫度再進(jìn)一步升高，多肽得率及水解度下降明顯（P＜0.05）。因此，選擇超聲溫度為50℃。

2.4 超聲時(shí)間對水解度和多肽得率的影響

改變超聲時(shí)間120、150、180、210、240 min，超聲溫度50℃、超聲功率為80 w，其他條件不變，測定水解度和多肽得率，結(jié)果見圖3。

圖3 超聲時(shí)間對水解度和多肽得率的影響Fig.3 The effect of ultrasound time on hydrolysis degree and the rate of polypeptide yield

圖4 加酶量對水解度和多肽得率的影響Fig.4 The effect of enzyme concentration on hydrolysis degree and the rate of polypeptide yield

由圖3可知，在超聲時(shí)間小于180 min前，隨著超聲時(shí)間的延長，水解度及多肽得率逐漸升高。當(dāng)超聲達(dá)到180 min后，隨著超聲時(shí)間延長，水解度及多肽得率升高不明顯。通過方差分析表明，超聲180、210、240 min三者之間差異不顯著（P＞0.05）。因此，選擇180 min為最佳超聲時(shí)間。

2.5 加酶量對水解度和多肽得率的影響

超聲溫度50℃、超聲功率80 w、超聲時(shí)間180 min，其他條件不變，研究不同加酶量（3500、4000、4500、5000、5500 U/g）對水解度和多肽得率的影響，結(jié)果見圖4。

圖4表明，加酶量對水解度及多的得率有一定影響，隨著加酶量的增加，水解度及多肽得率均呈現(xiàn)逐漸升高趨勢。加酶量5000 U/g與5500 U/g對水解度及多肽得率影響差異不明顯（P＞0.05），故加酶量5000 U/g為最佳加酶量。

2.6pH值對水解度和多肽得率的影響

超聲溫度50℃、超聲功率80 w、超聲時(shí)間180 min、加酶量5000 U/g，其他條件不變，調(diào)整反應(yīng)體系pH值分別為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5，測定水解度和多肽得率，結(jié)果見圖5。

圖5 pH值對水解度和多肽得率的影響Fig.5 The effect of pH value on hydrolysis degree and the rate of polypeptide yield

圖6 底物濃度對水解度和多肽得率的影響Fig.6 The effect of substrate concentration on hydrolysis degree and the rate of polypeptide yield

由圖5可以看出，水解度及多肽得率隨著pH值升高而升高，當(dāng)pH值大于6.0，隨著pH值得變化呈現(xiàn)下降趨勢，因此，山杏仁水解最佳pH值為6.0。

2.7 底物濃度對水解度和多肽得率的影響

固定超聲溫度為50℃、超聲功率為80 w、超聲時(shí)間為180 min、加酶量為5000 U/g，pH值為6，研究不同底物濃度（30、35、40、45、50、55 g/L）對水解度和多肽得率的影響，結(jié)果見圖6。

由圖6可知，隨著底物濃度的增加，水解度及多肽得率逐漸降低。方差分析表明，底物濃度40 g/L與35 g/L之間，水解度及多肽得率差異不明顯（P＞0.05），與30 g/L相比，水解度及多肽得率差異明顯（P＜0.05）。結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)效率，選擇底物濃度為40 g/L。

3 討論

制備生物活性肽是杏仁綜合利用最為主要的方向之一。相關(guān)研究表明杏仁蛋白能夠制備抗氧化性肽、ACE抑制肽、血小板聚集活性抑制肽、降血壓肽等生物活性肽[1,3,7,14]。而這些生物活性肽制備的前提是首先獲得杏仁多糖多肽水解液。以蛋白為原料制備多肽方法主要包括化學(xué)水解法、酶水解法及微生物發(fā)酵法，其中酶水解法目前是獲得食品級生物活性肽最主要的方法[5,6,8]。超聲波技術(shù)在生物活性物質(zhì)提取、制備方面表現(xiàn)了巨大的優(yōu)勢[15]。本研究將超聲波技術(shù)應(yīng)用于酶法制備山杏仁多肽研究中，取得了良好效果。同時(shí)證實(shí)低功率超聲波能夠提高山杏仁多肽制備效率，高功率超聲波起到相反作用。這可能是由于低強(qiáng)度超聲能夠提高酶的活性，高強(qiáng)度超聲能夠降低酶促反應(yīng)速度。這一研究結(jié)果與呂鵬的研究一致[16]。

4 結(jié)論

（1）研究證明，低于100 w的超聲波能夠有效的提高山杏仁多肽酶法制備效率，超聲功率高于120 w反而會降低了山杏仁多肽酶法制備效率；

（2）超聲輔助酶制備山杏仁多肽最優(yōu)工藝參數(shù)為：超聲功率80 w、超聲時(shí)間180 min、超聲溫度50℃、復(fù)合蛋白酶加量5000 U/g，pH值6，底物濃度40 g/L。

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Preparation ofApricot Kernel Polypeptide by Ultrasonic-assisted Enzymatic Hydrolysis

YU Guo-yong1,GUO Peng2,SUN Deng-yue2,FAN Jun-feng1*
1.College of Biological Sciences and Biotechnology,Beijing Forestry University,Beijing 100083,China 2.College of Food Science and Engineering,Shandong Agricultural University,Taian 271018,China

In the paper,the effect of the protease type,ultrasonic power,ultrasound temperature,ultrasonic time, enzyme concentration,pH value and substrate concentration on hydrolysis degree and the rate of polypeptide yield form apricot kernel was investigated.The optimal preparation technology of apricot kernel polypeptide was ultrasonic power 80 w, ultrasonic time 180 min,ultrasound temperature 50℃,Protamex concentration 5000 U/g,pH value 6.0 and substrate concentration 40 g/L.Under the optimum condition,the rate of polypeptide yield was 56.68±0.99%.

Apricot kernel;ultrasonic-assisted;protease;polypeptide

TS255.6

A

1000-2324(2014)03-0377-05

2013-01-22

2013-02-11

于國泳(1989-),男,漢族,碩士研究生,主要從事保健及功能食品研究.

*通訊作者:Author for correspondence.E-mail:fanjunfeng@bjfu.edu.cn