調節不同pH值的免疫吸附洗脫液的細菌內毒素測定

巖林蘋，曹燕麗，吳晶晶，王 婷，蘇 華，任海祥

（南京軍區南京總醫院制劑科，江蘇 南京 210002）

調節不同pH值的免疫吸附洗脫液的細菌內毒素測定

巖林蘋，曹燕麗，吳晶晶，王 婷，蘇 華，任海祥

（南京軍區南京總醫院制劑科，江蘇 南京 210002）

目的 選擇不同濃度的氫氧化鈉堿性調節劑或直接稀釋法對免疫吸附洗脫液的 pH值進行調節比較，建立免疫吸附洗脫液的細菌內毒素檢查方法。方法 根據《中國藥典》2010年版第二部附錄收載的細菌內毒素檢查方法，采用鱟試劑法對免疫吸附洗脫液進行干擾試驗。結果 稀釋32倍的免疫吸附洗脫液對細菌內毒素與鱟試劑的反應無干擾，選擇靈敏度為0.015 EU·mL-1的鱟試劑進行細菌內毒素檢查。結論 選擇直接稀釋法調節供試品的 pH值更優于低濃度氫氧化鈉堿性調節劑調節供試品的pH值對其進行細菌內毒素的檢查。

免疫吸附洗脫液；細菌內毒素；pH值；氫氧化鈉堿性調節劑

免疫吸附洗脫液是南京軍區南京總醫院自制制劑，其臨床上用于免疫性疾病，腎移植，中毒，腎小球疾病等。由于此藥的pH值過低，考慮到pH值過大或過小均可抑制鱟試劑與細菌內毒素的反應，其原因可能是pH值過大或過小均可破壞極微量的內毒素，因此為了保證免疫吸附洗脫液的用藥安全，控制藥品的生產質量，我們對如何調節本品的pH值進行了方法探討。

1 試驗儀器與試藥

1.1 儀器 ET-96細菌內毒素凝膠法測定儀（天津天大天發科技有限公司）；ZH-2自動漩渦混合器（天津藥典標準儀器廠）；試驗所用玻璃儀器均經過250℃干烤2 h。

1.2 試藥 細菌內毒素工作標準品（CSE）（規格：120 EU·mL-1批號：150601-200859，中國食品藥品檢定研究院）；鱟試劑（TAL）（規格：每支0.1 mL，靈敏度：0.062 5 EU·mL-1，廣東湛江安度斯生物有限公司，批號：1201110；廣東湛江博康海洋生物有限公司，批號：1207193）；鱟試劑（TAL）（規格：每支0.1 mL，靈敏度：0.015 EU·mL-1，廣東湛江安度斯生物有限公司，批號：1201103；廣東湛江博康海洋生物有限公司，批號：1203050）；細菌內毒素檢查用水（BET）（規格：每支5 mL，廣東湛江博康海洋有限公司，批號：1201180）；無水氫氧化鈉（規格：500 g，分析純，上海實意化學試劑有限公司，批號：090610）；免疫吸附洗脫液（規格：每袋500 mL，南京軍區南京總醫院自制藥品，批號：120911、120916、120924）。

2 方法和結果

2.1 鱟試劑靈敏度復核實驗 按照《中國藥典》2010年版二部附錄XIE規定的細菌內毒素檢查法規定［1］，進行鱟試劑的標示靈敏度復核，結果見表1。所用的鱟試劑靈敏度均符合規定，可用于細菌內毒素的檢查。

2.2 細菌內毒素限值（L）的確定 根據免疫吸附洗脫液說明書得知本品最大用量為80 mL／（60 kg ·h）。根據公式：細菌內毒素限值（L）＝K／M。K為人用每公斤體重每小時最大可接受的內毒素劑量，本注射劑為 K＝5 EU·kg-1·h-1，其中 M為人用每公斤每小時的最大供試品量本品為80 mL／（60 kg·h），則 L＝3.75 EU·mL-1。考慮到臨床聯合用藥的安全性和細菌內毒素的累加性，在上述計算限制的基礎上將限值提高7.5倍，由此確定免疫吸附洗脫液的細菌內毒素限值為 0.5 EU·mL-1［2］。

表1 鱟試劑靈敏度復核

2.3 凝膠半定量法測定 將 3批免疫吸附洗脫液，用細菌內毒素檢查用水在去除內毒素的容器中配制成兩種不同濃度（0.1、0.05 mol·L-1）的氫氧化鈉堿性調節劑，分別對原液、稀釋后的2、4、8倍供試品溶液進行 pH值調節至大約為6.5左右［3］（調節過程：分別取供試品每個梯度溶液1 mL于試管中，滴一滴酚酞指示劑，用刻度移液管緩緩加入氫氧化鈉堿性調節劑，溶液變色時分別記下氫氧化鈉堿性調節劑的用量；再另取去除熱原的試管，直接按前一步驟記錄的氫氧化鈉堿性調節劑的用量分別加入供試品的每個梯度中）。采用兩個廠家 λ為0.062 5 EU·mL-1的鱟試劑，按《中國藥典》2010年版二部附錄XIE規定的細菌內毒素凝膠半定量檢查法進行檢測［4］。

表 2 細菌內毒素凝膠半定量法檢測結果 （0.1 mol·L-1NaOH）

由表 2可知，（0.1 mol·L-1）氫氧化鈉堿性調節劑對3批免疫吸附洗脫液進行 pH值調節，結果雖能有效調節pH值，但供試品陽性對照（PPC）管均為陰性，表明內毒素失去活性，可能因為氫氧化鈉堿性調節劑濃度過高，破壞內毒素，使其失活，此方法不可行。因此選擇低濃度（0.05 mol·L-1）氫氧化鈉堿性調節劑調節供試品pH值，再進行半定量檢測。

表3結果表明，（0.05 mol·L-1）氫氧化鈉堿性調節劑對3批免疫吸附洗脫液進行 pH值調節，既能有效調節供試品 pH值，又可保留內毒素活性，通過計算［公式CE＝antilg（∑X／2）］，系列溶液內毒素濃度的幾何平行值（CE）均在規定范圍內，方法可行。

2.4 選擇高靈敏度的鱟試劑，采用直接稀釋法對免疫吸附洗脫液進行細菌內毒素驗證［5-7］

2.4.1 干擾預試驗 取3批免疫吸附洗脫液用BET水分別稀釋為2、4、8、16、32倍稀釋液，將此系列濃度溶液記為供試品陰性對照（NPC）。另制備同樣系列濃度的供試液，并使2、4、8、16、32倍稀釋液的供試品中均含有 2 λ濃度的細菌內毒素，將此系列溶液記為供試品陽性對照（PPC）。取2個廠家靈敏度為 0.015 EU·mL-1的鱟試劑，分別與上述PPC和 NPC進行反應，每一濃度重復兩管，并設陽性對照（PC）和陰性對照（NC），對其進行干擾預試 驗，結果見表4。

表3 細菌內毒素凝膠半定量法檢測結果（0.05 mol·L-1NaOH）

表4 免疫吸附洗脫液干擾預試驗

從表4預試驗結果表明，供試品在32倍以上的稀釋倍數時，和 BET相容性較好，沒有干擾，將其初步判斷為供試品無干擾濃度。

表5 免疫吸附洗脫液的干擾試驗

2.4.2 正式干擾試驗 為了最終確認是否存在抑制因素的影響，進行正式干擾試驗。取3批免疫吸附洗脫液用 BET水分別稀釋為32倍，用32倍稀釋液和BET水分別將CSE稀釋制得 0.03（2 λ）、0.015（λ）、0.007 5（0.5 λ）、0.003 75（0.25 λ）EU· mL-1系列內毒素濃度溶液，與2個廠家靈敏度為0.015 EU·mL-1的鱟試劑反應，每一濃度平行做 4管。另取0.1 mL BET水或供試品 32倍稀釋液加入0.1 mL BET水復溶的TAL安瓿中，各平行做兩管，作為陰性對照（NC）。按 2010年版中國藥典細菌內毒素檢查供試品干擾試驗進行試驗，結果見表5。

表5表明，上述3批供試品對兩個廠家鱟試劑的 Et均在 0.5～2.0 Es之間，因此供試品在 32倍稀釋時對鱟試劑試驗均無干擾，可進行細菌內毒素檢查。

2.4.3 供試品細菌內毒素凝膠法檢查 取上述 3批供試品分別稀釋32倍，使用兩批不同廠家靈敏度為0.015 EU·mL-1的TAL，按2010年版中國藥典細菌內毒素檢查法檢查，并同時設立陰性對照（NC）和陽性對照（PC），結果見表6。結果符合規定。

表6 免疫吸附洗脫液的細菌內毒素凝膠法檢查

3 討論

免疫吸附洗脫液的酸性較大，細菌內毒素檢測時干擾嚴重。目前認為強堿物質本身不存在內毒素，可使用于酸度調節［8］，本試驗用自制的 0.1、0.05 mol·L-1的氫氧化鈉堿性調節劑，分別調節本品 pH值約至6.5，即可排除干擾。

根據2010年版《中國藥典》規定，細菌內毒檢查法中鱟試劑的反應混合液（TAL+供試品）的 pH值應在6～8范圍內，本品的 pH值為 2.4左右，稀釋成2、4、8倍后，相應的 pH值3.3、4.2、4.8左右，仍不在范圍內，采用（0.1 mol·L-1）和（0.05 mol· L-1）兩個濃度的無熱原的氫氧化鈉堿性調節劑將供試品的pH值調節至 6.5左右，進行細菌內毒素凝膠半定量檢查試驗，表 2、表 3結果表明，用于調節供試品溶液pH值的氫氧化鈉堿性調節劑濃度越小，就會使內毒素失去活性的幾率越小。

考慮到氫氧化鈉堿性調節劑雖無熱原，但仍屬于外添加物質，于是在不添加氫氧化鈉堿性調節劑的情況下，對3批供試品進行向下稀釋，現用BET水在容許范圍內對供試品進行稀釋，目前市售的普通鱟試劑 λ通常在 0.5～0.062 5 EU·mL-1之間，但鱟試劑 λ為0.062 5 EU·mL-1時，最大稀釋倍數為16倍的供試品 pH值為5.2左右，不在藥典規定的 pH范圍內（6～8），因此選擇兩家高靈敏度的鱟試劑（0.015 EU·mL-1），對供試品進行相對應的進一步稀釋，得2、4、8、16、32倍的溶液，測得32倍稀釋液的pH值為 5.8左右，比較接近藥典規定的pH值范圍。而 BET水和鱟試劑本身對供試品 pH值具有一定的緩沖作用，干擾預試驗的結果顯示供試品在32倍稀釋時與 BET相容性較好，沒有干擾，可以進行正式的干擾試驗。

本試驗結果表明，選用低濃度的氫氧化鈉堿性調節劑對供試品進行 pH值調節，方法可行，可節約成本，目前普遍采用該法。但每次試驗均需臨時配制，配制出的溶液 pH值都會不同，且每次均需測試酸堿調節劑用量，相當繁瑣，更重要的是不能保證配制過程沒有污染。而選用高靈敏度鱟試劑，直接稀釋法可簡化流程，排除干擾，且干擾試驗是成立的，所以認為此方法是可行并成立的。

［1］ 國家藥典委員會.中國藥典：二部［S］.北京：中國醫藥科技出版社，2010：附錄100.

［2］ 王銀娟，陸 崟，巖林蘋，等.復方磷酸鹽注射液細菌內毒素檢查方法的研究［J］.中國醫藥導報，2011，8（32）：49-50.

［3］ 陸 崟，汪 玥，王銀娟，等.免疫吸附洗脫液細菌內毒素檢查方法的研究［J］.中國研究生學報，2012，25（10）：1032-1034.

［4］ 蔡慶祥，陳維成.凝膠半定量法檢測參附注射液細菌內毒素含量［J］.海峽藥學，2007，19（1）：47.

［5］ 何 進，史國兵，高 軍，等.枸櫞酸鈉注射液細菌內毒素檢查方法的考察［J］.解放軍藥學學報，2011，27（3）：254-255.

［6］ 武玉虹，劉麗梅，姚紅誼.注射用輔酶 I的細菌內毒素檢查［J］.安徽醫藥，2013，17（6）：950-952.

［7］ 朱 勤.復合磷酸氫鉀注射液的細菌內毒素檢查法［J］.安徽醫藥，2012，16（8）：1190-1192.

［8］ 國 明，胡文紅，郝玲玲，等.注射用氨力農細菌內毒素檢查方法學研究［J］.齊魯藥事，2007，26（8）：473-475.

Bacterial endotoxin test with immune adsorption eluent by adjusting pH value

YAN Lin-ping，CAO Yan-li，WU Jing-jing，et al
（Department of Preparation，Nanjing General Hospital of Nanjing Military Command，Nanjing，Jiangsu 210002，China）

Objective To establish a method for testing bacterial endotoxin with immune adsorption eluent by adjusting pH value with sodium hydroxide at different concentration as an alkalinity regulator or by direct dilution method.Methods The interference experiments with tachypleus amebocyte lysate（TAL）method on the immune adsorption eluents were performed according to the bacterial endotoxin test in Chinese Pharmacopoeia 2010（Section 2）.Results The immune adsorption eluent did not interfere with the bacterial endotoxins test when it was diluted 32 times.Tachypleus amebocyte lysate was used with the sensitivity of 0.015 EU·mL-1.Conclusions It is better to adjust pH value by direct dilution method for testing bacterial endotoxin of immune adsorption eluent than with sodium hydroxide as an alkalinity regulator.

immune adsorption eluent；bacterial endotoxins；pH；sodium hydroxide alkalinity regulator

10.3969／j.issn.1009-6469.2014.05.012

2013-08-14，

2014-01-06）

任海祥，男，副主任藥師，研究方向：醫院制劑，E-mail：suhuash＠sina.com.cn