PI3K抑制劑對(duì)人系膜細(xì)胞增殖的影響

馬 莉張春江李 宏趙 丹陳建平楊 軍楊曉萍△

PI3K抑制劑對(duì)人系膜細(xì)胞增殖的影響

馬 莉1張春江2李 宏3趙 丹2陳建平1楊 軍3楊曉萍2△

目的 探討磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）抑制劑LY294002對(duì)體外培養(yǎng)的人腎小球系膜細(xì)胞增殖的影響，為進(jìn)一步研究人系膜細(xì)胞增殖的發(fā)生機(jī)制提供依據(jù)。方法體外培養(yǎng)人系膜細(xì)胞，同步化后，用含有0.02、0.2、2、20、100 mg∕L濃度的LY294002進(jìn)行干預(yù)處理，倒置相差顯微鏡動(dòng)態(tài)觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)，用細(xì)胞增殖與活性檢測(cè)試劑盒CCK-8檢測(cè)人系膜細(xì)胞的增殖情況；選擇抑制人系膜細(xì)胞增殖作用較佳的LY294002濃度,分別培養(yǎng)0.5、1、24、48 h后用CCK-8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞的增殖情況。結(jié)果0.02 mg∕L LY294002對(duì)人系膜細(xì)胞無(wú)明顯的抑制作用（P＞0.05），抑制率僅為5.05％；在0.2～20 mg∕L濃度范圍內(nèi)，LY294002抑制細(xì)胞增殖的作用隨濃度的增大而增強(qiáng)，呈劑量依賴性（P＜0.05），當(dāng)濃度大于20 mg∕L時(shí)，抑制率可達(dá)96.75％，細(xì)胞停止生長(zhǎng)。2 mg∕L LY294002作用0.5 h對(duì)人系膜細(xì)胞增殖的抑制不明顯（P＞0.05）；作用1 h具有顯著的抑制作用（P＜0.05）；作用1～48 h，LY294002抑制細(xì)胞增殖的能力逐漸增強(qiáng)（P＜0.05）。結(jié)論LY294002在一定濃度和時(shí)間范圍內(nèi)具有抑制人系膜細(xì)胞增殖的作用，PI3K∕Akt∕mTOR信號(hào)通路可能調(diào)控人系膜細(xì)胞的增殖。

1-磷脂酰肌醇3-激酶；腎小球系膜細(xì)胞；PI3K∕Akt∕mTOR信號(hào)通路；細(xì)胞增殖；LY294002

系膜細(xì)胞（mesangial cell，MC）進(jìn)行性異常增生最終將進(jìn)展為腎小球硬化、腎功能衰竭，而早期抑制系膜細(xì)胞的增殖對(duì)改善和延緩病情至關(guān)重要。磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）-蛋白激酶B（PKB∕Akt）-哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信號(hào)通路被認(rèn)為是細(xì)胞存活、增殖及凋亡過(guò)程中的關(guān)鍵通路之一[1-2]。但目前有關(guān)人系膜細(xì)胞增殖與PI3K∕Akt∕mTOR信號(hào)通路之間的關(guān)系少有報(bào)道。本研究將PI3K抑制劑LY294002作用于體外培養(yǎng)的人系膜細(xì)胞，觀察其對(duì)人系膜細(xì)胞體外增殖的影響，旨在初步探討人系膜細(xì)胞增殖的相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與試劑

1.1.1 細(xì)胞株 人系膜細(xì)胞株購(gòu)自湘雅醫(yī)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室，本課題組前期通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察及免疫熒光實(shí)驗(yàn)鑒定為人系膜細(xì)胞。

1.1.2 主要試劑 LY294002購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，用DMSO（美國(guó)Sigma公司）稀釋成儲(chǔ)存濃度，用含5％胎牛血清（FBS，美國(guó)HyClone公司）的低糖DMEM培養(yǎng)液（L-DMEM，美國(guó)HyClone公司）稀釋為工作濃度。CCK-8試劑盒（美國(guó)Sigma公司），0.25％胰蛋白酶(美國(guó)Gibco公司）。

1.2 儀器與設(shè)備 倒置相差顯微鏡（日本Olympus公司）、ELX-800酶標(biāo)儀（美國(guó)Biokit公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) 用L-DMEM完全培養(yǎng)基（10％FBS，100 U∕mL青霉素，100 mg∕L鏈霉素）復(fù)蘇細(xì)胞株，置于5％CO2、37℃飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至70％～80％融合時(shí)，用0.25％胰蛋白酶消化，傳代繼續(xù)培養(yǎng)，第3～7代用于實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 CCK-8試劑盒檢測(cè)人系膜細(xì)胞的增殖 取對(duì)數(shù)期人系膜細(xì)胞，調(diào)整濃度為1×104個(gè)∕mL，200 μL∕孔接種于96孔板內(nèi)；待細(xì)胞完全貼壁（12～24 h）后棄去培養(yǎng)基，PBS沖洗2次，加入L-DMEM同步化24 h；加入不同濃度（0.02、0.2、2、20、100 mg∕L）的LY294002，每孔100 μL，對(duì)照組為含5％ FBS的L-DMEM，每孔100 μL。干預(yù)48 h后加入100 μL LDMEM及10 μL CCK-8溶液，避光37℃孵育4 h后振蕩10～15 min，酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔在450 nm波長(zhǎng)處的吸光度（A450）值。每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔，設(shè)置空白調(diào)零孔(只加L-DMEM 及CCK-8溶液)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次以上，并計(jì)算抑制率（Inhibition Rate，IR）=（A對(duì)照組-A實(shí)驗(yàn)組）∕A對(duì)照組×100％。選擇抑制人系膜細(xì)胞增殖作用較佳的LY294002濃度，分別培養(yǎng)0.5、1、24、48 h后，用CCK-8試劑盒按說(shuō)明書(shū)操作檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，以±s表示，組間比較采用one-way ANVOA檢驗(yàn)，進(jìn)一步兩兩比較用LSD-t法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 人系膜細(xì)胞形態(tài)觀察 未處理的細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形、不規(guī)則星形或樹(shù)枝狀，胞核居中，呈圓形或卵圓形，較清晰，增殖活躍的細(xì)胞可呈放射狀，細(xì)胞可聚集成小丘狀胞體，見(jiàn)圖1A。2 mg∕L LY294002處理48 h后，細(xì)胞核數(shù)目明顯減少，胞體長(zhǎng)梭形突出或消失，見(jiàn)圖1B。20、100 mg∕L的LY294002處理48 h后，人系膜細(xì)胞胞質(zhì)回縮明顯，呈圓形，分別見(jiàn)圖1C、1D。

2.2 不同濃度LY294002對(duì)人系膜細(xì)胞增殖的影響 與對(duì)照組相比，0.2、2、20、100 mg∕L LY294002對(duì)系膜細(xì)胞有顯著的抑制作用（P＜0.05）；而0.02 mg∕L組對(duì)系膜細(xì)胞無(wú)明顯的抑制作用（P＞0.05），抑制率僅為5.05％。2、20、100 mg∕L的抑制作用顯著高于0.2 mg∕L（P＜0.05）。20、100 mg∕L顯著抑制系膜細(xì)胞的增殖，抑制率分別為96.75％、95.31％，但兩者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表1。

Tab.1 Effect of different concentrations of LY294002 on proliferation of the cultured human glomerular mesangial cells表1 不同濃度LY294002對(duì)人系膜細(xì)胞增殖的影響(±s)

Tab.1 Effect of different concentrations of LY294002 on proliferation of the cultured human glomerular mesangial cells表1 不同濃度LY294002對(duì)人系膜細(xì)胞增殖的影響(±s)

＊P＜0.05；a與對(duì)照組比，b與0.2 mg∕L組比，c與2 mg∕L組比，P＜0.05

LY294002質(zhì)量濃度(mg∕L) 0（對(duì)照組）0.02 0.2 2 20 100 F A450 0.805 3±0.026 2 0.764 6±0.033 3 0.471 3±0.048 8a0.349 8±0.017 9ab0.026 2±0.026 5abc0.037 8±0.033 3abc438.220＊IR(％) 0.00 5.05 41.48 56.56 96.75 95.31

2.3 2mg∕L LY294002作用不同時(shí)間對(duì)人系膜細(xì)胞增殖的影響 2 mg∕L LY294002作用0.5 h抑制系膜細(xì)胞增殖不明顯（A450=0.729 0±0.022 2），1 h（A450= 0.485 8±0.046 1）具有顯著的抑制作用（P＜0.05）；24 h（A450=0.441 4±0.046 3）較1 h細(xì)胞增殖差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；48 h（A450=0.349 8±0.017 9）抑制細(xì)胞增殖最明顯，均顯著高于0.5 h、1 h和24 h（P＜0.05）。

3 討論

腎小球細(xì)胞在哺乳動(dòng)物一生中增殖率很低，正常成年動(dòng)物腎小球系膜細(xì)胞的更新率約為1％[3]，但各種損傷因素可使腎小球系膜細(xì)胞活化、增殖，從而使系膜細(xì)胞成為病理?yè)p傷因素的受害者，同時(shí)成為各種病理過(guò)程的積極參與者。系膜細(xì)胞異常增殖的本質(zhì)是促進(jìn)與抑制增生的失衡，主要是DNA復(fù)制和蛋白質(zhì)的合成加速，G1∕S期和G2∕M期是細(xì)胞周期調(diào)控的2個(gè)關(guān)鍵時(shí)期，有賴于正性和負(fù)性周期調(diào)節(jié)蛋白之間的平衡。細(xì)胞周期正調(diào)控蛋白主要包括細(xì)胞周期蛋白（cyclin）和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)；細(xì)胞周期負(fù)調(diào)控蛋白為一組CDK抑制因子(CDKI)，它們可以與cyclin相互競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合CDK而抑制全酶的活性[4]。PI3K∕Akt∕mTOR信號(hào)通路參與多種細(xì)胞的生長(zhǎng)與增殖，該過(guò)程主要與細(xì)胞有絲分裂有關(guān)，其促進(jìn)有絲分裂的靶點(diǎn)主要是Akt活化后產(chǎn)生的下游分子，包括糖原合成激酶3β（GSK-3β）、mTOR、核糖體蛋白S6激酶（p70S6K）、真核啟動(dòng)因子4E結(jié)合蛋白（4EBPS）等，同時(shí)通過(guò)磷酸化CDKI （p21Cip1與p27Kip1），正調(diào)控cyclin∕CDK[1-2]，因此阻斷該信號(hào)通路的活化將抑制細(xì)胞的增殖。PI3K催化亞基p110的靶向抑制劑LY294002可以阻斷3-磷脂肌醇的產(chǎn)生，進(jìn)而阻斷此通路的活化，從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)[5-6]。

Huang等[7]證實(shí)PI3K∕Akt∕mTOR信號(hào)通路與人系膜細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖有關(guān)：PI3K活化后激活A(yù)kt，進(jìn)一步磷酸化mTOR，將有絲分裂信號(hào)傳遞給p70S6K，使細(xì)胞周期蛋白（如cyclinC、D、E）翻譯上調(diào)，縮短細(xì)胞周期、促進(jìn)增殖；LY294002用于阻斷人系膜細(xì)胞PI3K的適宜濃度為1 μmol∕L，時(shí)間為30 min。Tsai等[8]研究發(fā)現(xiàn)，LY294002抑制脂多糖∕干擾素γ（LPS∕IFN-γ）處理的小鼠腎小球系膜細(xì)胞（MES-13）增殖呈劑量依賴關(guān)系，10 μmol∕L的LY294002可以抑制細(xì)胞的增殖，但當(dāng)LY294002濃度為0.1～5 μmol∕L時(shí)，抑制增殖效應(yīng)不明顯。本研究結(jié)果顯示LY294002在0.2～20 mg∕L質(zhì)量濃度范圍內(nèi),其抑制體外培養(yǎng)的人系膜細(xì)胞增殖的作用隨質(zhì)量濃度的增大而增強(qiáng)，呈劑量依賴性，但當(dāng)LY294002濃度為 0.02 mg∕L時(shí)，抑制增殖效應(yīng)不明顯。CCK-8試劑中含有WST-8，其化學(xué)名為2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2，4–二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽，它在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸二甲酯的作用下被細(xì)胞線粒體中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的橙黃色甲臜產(chǎn)物，生成甲臜的數(shù)量與活細(xì)胞的數(shù)量成正比，用酶標(biāo)儀測(cè)定其吸光值，可間接反映活細(xì)胞的數(shù)量[9]。20、100 mg∕L的LY294002處理系膜細(xì)胞后，加入CCK-8試劑，測(cè)得吸光度值為0.03左右，說(shuō)明LY294002質(zhì)量濃度大于20 mg∕L時(shí)系膜細(xì)胞將停止生長(zhǎng)。PI3K∕Akt∕mTOR信號(hào)通路可以激活一系列生長(zhǎng)信號(hào)通路，阻斷一系列凋亡信號(hào)通路，從而促進(jìn)細(xì)胞的增殖。相反，阻斷此信號(hào)通路，可以促進(jìn)細(xì)胞的凋亡[1-2，10]。Shimamura等[11]研究表明PI3K∕Akt信號(hào)通路通過(guò)其下游產(chǎn)物核因子（NF）-κB調(diào)控大鼠系膜細(xì)胞的增殖及凋亡。因此，可以推測(cè)LY294002質(zhì)量濃度大于20 mg∕L時(shí)系膜細(xì)胞增殖受抑明顯，并誘導(dǎo)其凋亡。

LY294002作為PI3K特異性抑制劑之一，研究者通常以某一濃度作用細(xì)胞30 min或1 h阻斷PI3K的活化，因而廣泛用于PI3K相關(guān)信號(hào)通路的研究。本研究以抑制增殖作用較佳的LY294002質(zhì)量濃度（2 mg∕L）刺激系膜細(xì)胞，結(jié)果顯示在一定時(shí)間范圍內(nèi)（1～48 h），隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞增殖減少，呈時(shí)間依賴關(guān)系。2 mg∕L的LY294002作用0.5 h抑制系膜細(xì)胞增殖不明顯，1 h具有顯著的抑制作用，而24 h較1 h細(xì)胞增殖差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示2 mg∕L的LY294002作用1h即可顯著阻斷PI3K信號(hào)通路的活化。然而，實(shí)驗(yàn)過(guò)程受多種因素的影響，如培養(yǎng)條件、方法、細(xì)胞生長(zhǎng)時(shí)期、細(xì)胞密度及細(xì)胞表面受體的表達(dá)情況等，因此尚待進(jìn)一步研究。

綜上所述，PI3K抑制劑LY294002具有抑制體外培養(yǎng)的人系膜細(xì)胞增殖的作用，其抑制增殖的較佳質(zhì)量濃度為0.2～20 mg∕L，2 mg∕L的LY294002作用人系膜細(xì)胞1 h即可顯著阻斷PI3K信號(hào)通路的活化；PI3K∕Akt∕mTOR信號(hào)通路可能調(diào)控人系膜細(xì)胞的增殖。

Fig.1 Effect of different concentrations of LY294002 on proliferation of the cultured human glomerular mesangial cells(×200)圖1 不同濃度LY294002對(duì)人系膜細(xì)胞增殖的影響(×200)

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（2014-05-10收稿 2014-06-20修回）

（本文編輯 閆娟）

Effect of PI3K Inhibitor on Proliferation of Human Glomerular Mesangial Cells

MA Li1,ZHANG Chunjiang2,LI Hong3,ZHAO Dan2,CHEN Jianping1,YANG Jun3,YANG Xiaoping2△
1College of Medicine,Shihezi University,Xinjiang 832008,China；2 Division of Nephrology,The First Affiliated Hospital, College of Medicine,Shihezi University；3 Division of Central Laboratory,The First Affiliated Hospital,College of Medicine,Shihezi University
△

E-mail:sbkyxp@163.com

ObjectiveTo investigate the effect of LY294002 on proliferation of cultured human glomerular mesangial cells,and to study on the mechanism underlying this proliferation.MethodsDifferent concentrations of LY294002 (0.02，0.2，2，20，100 mg∕L)were administrated to the cultured human glomerular mesangial cells.The effects of mesangial cell proliferation were measured using CCK-8 colorimetric assay.Under appropriate concentrations,proliferation of cultured mesangial cells were measured using CCK-8 at 0.5,1,24,48 hours of drug administration time.ResultsLY294002（0.02 mg∕L）didn’t obviously inhibited the growth of mesangial cells（P＞0.05）,the inhibition rate was 5.05％.The effect of LY294002 on the cells decreased with rising concentration(0.2 to 20 mg∕L)in a dose-dependent manner(P＜0.05).Mesangial cells would stop growing with the increasing concentration.LY294002 didn’t obviously inhibited the growth of mesangial cells at 2 mg∕L during 0 to 1 h（P＞0.05）,but inhibited proliferation gradually from 1 to 48 h(P＜0.05). Conclusion Within the certain range of concentration and time,the LY294002 inhibits the proliferation of human glomerular mesangial cells,and PI3K∕Akt∕mTOR signaling pathway may regulate the proliferation of human mesangial cell.

1-phosphatidylinositol 3-kinase；mesangial cells;PI3-Kinase-Akt-mTOR pathway;cell proliferation；LY294002

R692.6

A

10.3969∕j.issn.0253-9896.2014.10.003

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81160090）

1石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院（郵編832008）;2石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腎病科;3石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室

△通訊作者 E-mail:sbkyxp@163.com