高效液相色譜法測定動物性食品中二氯二甲吡啶酚的不確定度評定

陳 玲① 馮修光① 李桂華② 尹伶靈① 薄永恒①

（①山東省獸藥質(zhì)量檢驗所 濟南 250022 ②山東省飼料質(zhì)量檢驗所）

試驗研究

高效液相色譜法測定動物性食品中二氯二甲吡啶酚的不確定度評定

陳 玲① 馮修光① 李桂華② 尹伶靈① 薄永恒①

（①山東省獸藥質(zhì)量檢驗所 濟南 250022 ②山東省飼料質(zhì)量檢驗所）

運用測量不確定度的基本方法和程序，建立高效液相色譜法測定雞肝中二氯二甲吡啶酚殘留量的測量不確定度評定的數(shù)學模型，對測量過程中的不確定因素來源進行分析和量化計算，得出高效液相色譜法測定雞肝中二氯二甲吡啶酚殘留量不確定度結(jié)果，當求得雞肝中二氯二甲吡啶酚的殘留量為78.0μg/kg 時，擴展不確定度為3.5μg/kg。

測量不確定度 高效液相色譜法 二氯二甲吡啶酚

氯羥吡啶是一種光譜抗球蟲藥，毒性小，對雞、兔的球蟲病均有較好效果。在國內(nèi)養(yǎng)殖業(yè)應用廣泛。但是一些禽養(yǎng)殖場經(jīng)常發(fā)生不合理用藥和濫用藥的情況，且不按規(guī)定執(zhí)行休藥期，這一類動物源性食品被人類長期食用會出現(xiàn)蓄積中毒，我國對該類藥物在動物組織中的最高殘留限量做出了嚴格的規(guī)定。本文對測定雞肝中二氯二甲吡啶酚含量的不確定度來源進行分析，并對測量不確定度進行評定。

1 材料與方法

1.1 方法提要 用甲醇提取試樣中二氯二甲吡啶酚，經(jīng)氧化鋁柱、陰離子交換柱凈化，用帶紫外檢測器的液相色譜儀測定二氯二甲吡啶酚殘留量，外標法定量。

1.3 前處理過程 測定方法參考SN/T0212.1- 1993標準方法，稱取約5g(精確至0.01g)試樣和5g無水硫酸鈉于50ml離心管中，加入甲醇8ml，渦旋混合提取1min，靜置0.5h，以4000r/min離心10nin。將上清液過氧化鋁柱和陰離子交換柱凈化，濾渣加甲醇渦旋，離心，過柱共2次，用甲醇8ml/次，待提取液全部通過氧化鋁柱后，用8ml甲醇淋洗兩柱，至此，棄去全部淋洗液，取下氧化鋁柱，將25ml容量瓶置于陰離子交換柱下，用0.5%乙酸甲醇溶液洗脫二氯二甲吡啶酚，洗脫液接至刻度，搖勻.自容量瓶中準確移取5ml洗脫液至10ml玻璃離心管中，于60的水浴中，緩慢用氮氣吹干，以0.50ml甲醇溶解殘渣，過0.45m有機系濾膜后供高效液相色譜分析。

2 被測量的數(shù)學模型

3 不確定度的來源

從測量過程和確定的數(shù)學模型分析，測量不確定度主要來源于以下幾個方面：（1）樣品稱量產(chǎn)生的不確定度；（2）樣品提取過程中產(chǎn)生的不確定度；（3）樣品洗脫液定容體積產(chǎn)生的不確定度；（4）樣品洗脫液取樣體積產(chǎn)生的不確定度；（5）樣品測試液定容體積產(chǎn)生的不確定度；（6）測定樣品測試液中二氯二甲吡啶酚濃度產(chǎn)生的不確定度。

4 測量不確定度的評定

4.1 樣品稱量產(chǎn)生的標準不確定度

4.1.1 天平校準產(chǎn)生的標準不確定度u1(m) 天平檢定證書給出天平的線性分量是±0.0001g，線性分量被假設為矩形分布，換算成標準不確定度為u1(m)＝0.0001g/ 1.732=0.00006g。

4.1.2 重復稱量產(chǎn)生的標準不確定度u2(m) 本次驗證做了5個平行樣，對5號樣品進行6次重復稱量，稱量結(jié)果分別為：0.5009、0.5010、0.5010、0.5008、0.5009、0.5011g。其平均值m= 0.5010g，標準偏差s(m)=0.0001g，按A類評定重復稱量樣品引起的標準不確定度，則：u2(m)＝s(m)/2.449＝0.000041g，將u1(m)、u2(m)進行合成，則樣品稱量產(chǎn)生的標準不確定度為：相對標準不確定度為：

4.2 樣品測試液定容體積產(chǎn)生的標準不確定度

使用GILSON G系列單道微量固定移液器一支，儀器商給出技術參數(shù)：精度等級±0.6%，加甲醇0.500ml，即0.003ml。假設矩形分布，標準不確定度為：u(V1)＝0.003/1.732＝0.0018ml；相對標準不確定度為：u(V1)/V1＝0.0018/0.500＝0.0036。

4.3 樣品洗脫液定容體積產(chǎn)生的不確定度

4.3.1 容量瓶校準產(chǎn)生的標準不確定度u1(V3) 依據(jù)JJG-196-1990“常用玻璃量器檢定規(guī)程”，A級25ml容量瓶的最大允許誤差為±0.03ml，按三角分布考慮，k=2.449則，u1(V1)=0.03/2.449=0.012 ml

4.3.2 溶液溫度與校準溫度不同產(chǎn)生的標準不確定度

u2(V3) 假設溶液溫度與校準溫度的差異為±5℃，容量瓶的體積V1=25ml，0.5%醋酸甲醇的膨脹系數(shù)近似采用水的膨脹系數(shù)α=2.1X10-4℃-1(玻璃的膨脹系數(shù)太小α=1.5X10-5℃-1，忽略不計)，按矩形分布考慮，k=1.732則：u2(V3)＝V3× α×5/k＝0.015ml。

4.3.3 25ml容量瓶刻度觀察變動性u3(V3) 根據(jù)多次試驗統(tǒng)計，u3(V3)＝0.010ml。將標準不確定度分量u1(V3)，u2(V3)，u3(V3)進行合成，則樣品從陰離子柱洗脫后定容到25ml容量瓶中產(chǎn)生的標準不確定度為：u(V3)25ml容量瓶中產(chǎn)生的相對標準不確定度為：u(V3)/V3＝0.021/25＝0.00084。

4.4 樣品洗脫液取樣體積產(chǎn)生的標準不確定度

5.00ml移液管的最大允許誤差為±0.015ml，用5.00ml移液管移取樣品消解液產(chǎn)生的標準不確定度為：u(V2)=0.0070ml；5.00ml移液管移取樣品消解液產(chǎn)生的相對標準不確定度為：u(V3)/V3＝0.0070/5＝0.0014

4.5 測定樣品測試液中的二氯二甲吡啶酚濃度產(chǎn)生的標準不確定度

4.5.1 二氯二甲吡啶酚標準儲備液配制產(chǎn)生的標準不確定度u(Cs) （1）二氯二甲吡啶酚標準儲備液稱量產(chǎn)生的標準不確定度u(Cc)。①天平校準產(chǎn)生的標準不確定度u1(Cc)。天平檢定證書給出天平的線性分量是±0.01mg，線性分量被假設為正態(tài)分布，換算成標準不確定度為：u1(Cc)＝0.01mg/1.96=0.00510mg。②重復稱量產(chǎn)生的標準不確定度u2(Cc)。標準品用稱量壺重復稱量6次(0.02226、0.02225、0.02228、0.02227、0.02226、0.02224/g)，標準偏差為s＝0.01414mg，按A類評定重復稱量樣品引起的標準不確定度為u2(Cc)＝s/2.449＝0.00578mg。③標準品純度引起的標準不確定度u3(Cc)。標準品證書給出的純度為98.5%±0.5%，即0.985±0.005按均勻分布轉(zhuǎn)換成標準不確相對標準不確定度為：u(Cc)/m＝0.00823/22.26＝0.00037。（2）二氯二甲吡啶酚標準儲備液稀釋產(chǎn)生的標準不確定度u(V100)。將標準品用甲醇溶解并定容到200ml容量瓶，得Cs＝100μg/ml的二氯二甲吡啶酚標準儲備液。200ml單標線容量瓶的最大允許誤差為±0.13ml，按3.3的評定方法進行評定，甲醇的膨脹系數(shù)近似采用水的膨脹系數(shù)α=2.1X10-4℃-1，則用200ml容量瓶定容產(chǎn)生的標準不確定度為：u(V100)＝0.133ml，相對標準不確定度為：u(V100)/V100＝0.00067。稀釋過程c＝m/v，所以u(Cs)/Cs＝[u(V100)/V100]2+[u(Cc)/ m]2＝0.00076，u(Cs)＝0.076μg/ml。

4.5.2 由二氯二甲吡啶酚標準儲備液配制成二氯二甲吡啶酚標準工作溶液產(chǎn)生的標準不確定度 用10ml移液管移取10.00ml二氯二甲吡啶酚標準儲備液并定容到100ml容量瓶，得10μg/ml的二氯二甲吡啶酚標準中間液。分別精密量取1.00、1.00、2.00、5.00、5.00、10.00ml至200、100、100、100、50、50ml容量瓶中并定容，配制成0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0μg/ml的系列溶液。按3.3的評定方法進行評定，甲醇的膨脹系數(shù)近似采用水的膨脹系數(shù)α=2.1X10-4℃-1，各不確定度分量互不相關，合成得各濃度標準工作溶液稀釋過程中的相對標準不確定度，見表1。定度為u3(Cc)=0.005/1.732 =0.00289mg。將上述獨立因素的不確定度 u1(Cc)、u2(Cc)、u3(Cc)進行合成，則二氯二甲吡啶酚標準儲備液稱量產(chǎn)生的標準不確定度為：u(Cc)

表1 相對標準不確定度 (mg/ml、ml)

所以此項最大相對標準不確定度u(V玻儀)/V玻儀＝0.0032。

4.5.3 5份樣品重復測量產(chǎn)生的相對標準不確定度u1(C0)對每份樣品測試液進行2次重復測定，進行不確定度A類評定，結(jié)果列于表2。

4.5.4 標準工作曲線求CO時產(chǎn)生的標準不確定度 二氯二甲吡啶酚系列標準工作溶液的色譜峰面積I與濃度，結(jié)果列于表3：

利用表2中的數(shù)據(jù)，使用線性最小二乘法擬合標準工作曲線，得線性回歸方程I=aCX+b，相關系數(shù)r=0.99998，斜率a=66300ml/μg，截距b=462。

表2 各濃度單位不確定度A類評定 (μg/ml)

表3 標準曲線求C0產(chǎn)生的不確定度 (μg/ml)

由標準工作曲線求CO時產(chǎn)生的標準不確定度u2(CO)按下式計算：

式中：u2(CO)—繪制標準工作的曲線求CO時產(chǎn)生的標準不確定度(μg/ml)；S—也稱標準曲線殘差；a、b—分別表示標準工作曲線的斜率(ml/μg)、截距；P—樣品測試液的測定次數(shù)；n—標準工作溶液的測定次數(shù)；CO—樣品測試液中二氯二甲吡啶酚的濃度(μg/ml)；Ci，Ii—分別為系列標準工作溶液對應的二氯二甲吡啶酚濃度(μg/ml)和峰面積值。將有關數(shù)據(jù)P=2，n=18，C=0.7035μg/ml，CO(見表1)，代入得標準曲線殘差S＝359.27，標準工作曲線產(chǎn)生的標準不確定度見表4。

表4 標準工作曲線產(chǎn)生的標準不確定度

由表4可以看出平行樣品間的u2(CO)/CO基本無差異。上述不確定度互不相關，合成得：

4.6 樣品提取過程中產(chǎn)生的標準不確定度

將該項標準不確定度計算入重復性操作分量中，并利用樣品濃度的標準偏差S差量化。

表5 標準偏差S的有關數(shù)據(jù) (g、μg/ml)

進行不確定度A類評定，標準不確定度u(R)＝S/2.236＝0.0105μg/ml，相對標準不確定度u(R)/C＝0.0105/5.213＝0.0020。

5 合成標準不確定度

上述各項不確定度分量彼此相互獨立，則5號樣中二氯二甲吡啶酚含量的相對合成標準不確定度為：樣品濃度w＝5.218μg/g，合成標準不確定度為：u(w)=0.0069×w＝0.036μg/g；同理計算各平行樣的合成標準不確定度(表6)。

表6 各平行樣的合成標準不確度度

取最大值1號樣品的合成標準不確定度u(w)＝0.037μg /g做為編號060樣品的合成標準不確定度。

6 擴展不確定度及測定結(jié)果表示

取包含因子K=2，則測量結(jié)果的擴展不確定度為：U=Ku(W)=2×0.037μg/g＝0.074μg/g，編號060樣品平均濃度w＝5.213μg/g，樣品測量結(jié)果表示為：(5.213±0.074)μg /g(k=2)，即(5.213±0.074)mg/kg(k=2)。

7 結(jié)論

通過對各不確定度分量的量化和分析可以看出，二氯二甲吡啶酚含量測量不確定度主要來源于樣品提取、利用標準曲線測量和樣品測試液定容過程中產(chǎn)生的不確定度。

[1] 國家質(zhì)量技術監(jiān)督局. JJF1059—1999測量不確定度評定與表示[S].北京: 中國計量出版社, 1999.

[2] 中國合格評定國家認可委員會. 化學分析中不確定度的評估指南

[S]. 北京: 中國計量出版社, 2007.

[3] 國家質(zhì)量技術監(jiān)督局. JJG196- 2006 常用玻璃量器檢定規(guī)程. 北京: 中國計量出版社, 2007.

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S859.83

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1007-1733(2014)01-0005-03

2013–08–05）