TTTT急性犬瘟熱感染組織臟器的研究

彭京城 （江蘇省新沂市動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所 221400）

臨床中的犬瘟熱病毒感染多為急性和亞急性型，犬年齡在6月齡左右，其癥狀和病毒復(fù)制的臟器都與慢性病例有很大區(qū)別。臨床上急性病例的主要病變集中在肺臟和淋巴組織，組織病理學(xué)觀察到犬淋巴結(jié)炎和多核巨細(xì)胞性肺炎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料 新沂市城區(qū)肉狗養(yǎng)殖基地，急性犬瘟熱病死犬4只，心臟、肝臟、肺臟、腎臟、淋巴結(jié)、膀胱、大腦和脾臟。

1.1.2 主要試劑 二甲苯I、二甲苯II、ph6.0、0.01的檸檬酸溶液、100%乙醇II、95%乙醇、75%乙醇、3%過(guò)氧化氫、pbs液等。

1.1.3 主要儀器 組織切片機(jī)、恒溫培養(yǎng)箱、光學(xué)顯微鏡等。

1.2 方法

1.2.1 組織病理學(xué)檢測(cè) 臨床剖檢，采集臟器包括心臟、肝臟、肺臟、腎臟、淋巴結(jié)、膀胱、大腦和脾臟。制作組織切片，使用10%的福爾馬林中和緩沖液固定組織，石蠟包埋，切成5mm的切片，用常規(guī)的蘇木精和伊紅(HE)染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.2.2 免疫組織化學(xué)方法 （1）脫蠟脫水：組織學(xué)切片在經(jīng)二甲苯I、二甲苯II各60min脫蠟，100%乙醇I、100%乙醇II、95%乙醇、75%乙醇逐級(jí)脫水，每級(jí)5min。（2）抗原修復(fù)：ph6.0，0.01的檸檬酸溶液高壓煮沸3min。（3）封閉內(nèi)源性酶：在組織切片上，滴加3%過(guò)氧化氫，以組織完全覆蓋為宜，在室溫下處理20min。以封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶。pbs洗滌3次，5min/次。（4）封閉：滴加5%山羊血清于組織切片上，在37℃下反應(yīng)30min，封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)。（5）一抗孵育：滴加最佳稀釋度的單抗(1:200)37℃復(fù)溫45min，棄去單抗，pbs洗滌3次，5min/次。（6）二抗孵育：滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗(1:500)，在37℃中反應(yīng)45min洗滌6次，5min/次。（7）顯色：滴加DAB反應(yīng)液，室溫下反應(yīng)5～10min，顯色后充分洗滌，終止反應(yīng)。（8）復(fù)染：蘇木精溶液染色30～60s，乙醇鹽酸分色2s，水中沖洗5min。（9）脫水封片：經(jīng)75%、95%、100%各級(jí)乙醇，每級(jí)3min。入乙醇和二甲苯(1:1)溶液2min，入二甲苯中5min至透明，加中性樹(shù)膠后蓋蓋玻片，封片，鏡檢。

2 結(jié)果

2.1 組織病理學(xué)觀察

2.1.1 大腦 大腦白質(zhì)和灰質(zhì)中病理病變不明顯，在部分大腦灰質(zhì)區(qū)域觀察到小膠質(zhì)細(xì)胞靠近神經(jīng)元胞體的現(xiàn)象—嗜神經(jīng)現(xiàn)象。神經(jīng)元胞體中尼氏小體正常，無(wú)明顯組織病理學(xué)變化(見(jiàn)圖1)。

2.1.2 肺臟 泡腔中有大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，纖維素性滲出，血管充血，出血，肺泡腔中出現(xiàn)多核巨細(xì)胞，胞漿深染，胞漿中有5～7個(gè)細(xì)胞核排列在胞體的周邊，診斷為典型的犬瘟熱多核巨細(xì)胞性肺炎(見(jiàn)圖2)。

2.1.3 淋巴結(jié) 光學(xué)顯微鏡下觀察，低倍鏡下可見(jiàn)，可見(jiàn)到淋巴結(jié)結(jié)構(gòu)疏松，淋巴細(xì)胞減少，被膜下淋巴竇增寬，質(zhì)區(qū)染色淺，淋巴小結(jié)結(jié)構(gòu)不明顯。高倍鏡下，觀察到皮質(zhì)區(qū)被膜下淋巴竇和皮質(zhì)淋巴竇中，有大量吞噬異物的巨噬細(xì)胞，網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞增生，淋巴結(jié)髓質(zhì)區(qū)大量淋巴小結(jié)被破壞，診斷為淋巴節(jié)炎(見(jiàn)圖3)。

2.1.3 膀胱 膀胱粘膜完整，在400倍光學(xué)顯微鏡下可以觀察到，在犬膀胱粘膜變移上皮中出現(xiàn)犬瘟熱病毒包涵體(見(jiàn)圖4)。

2.2 免疫組織化學(xué)結(jié)果

2.2.1 大腦 光學(xué)顯微鏡下觀察免疫組化切片，大腦白質(zhì)和灰質(zhì)的神經(jīng)元細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞、錐狀細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)均沒(méi)有觀察到有犬瘟熱病毒抗原特異性染色。

2.2.2 肺臟 光學(xué)顯微鏡下觀察免疫組化切片，在肺臟的支氣管上皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中觀察免疫標(biāo)記呈陽(yáng)性，但是陽(yáng)性細(xì)胞量較少。

2.2.3 淋巴結(jié) 光學(xué)顯微鏡下觀察免疫組化切片，在淋巴結(jié)皮質(zhì)的淋巴小結(jié)中有強(qiáng)免疫標(biāo)記陽(yáng)性反應(yīng)。而在髓質(zhì)區(qū)則表現(xiàn)為免疫標(biāo)記呈陰性反應(yīng)(見(jiàn)圖5和圖6)。

2.24 膀胱 在膀胱黏膜上皮中沒(méi)有觀察到包涵體免疫標(biāo)記陽(yáng)性反應(yīng)。

圖1 腦組織輕度嗜神經(jīng)現(xiàn)象H.E.200х

圖2 多核巨細(xì)胞性肺炎 H.E.200х

圖3 淋巴結(jié)炎H.E.400х

圖4 膀胱粘膜內(nèi)包涵體 H.E.200х

圖5 淋巴結(jié)炎免疫組織化學(xué)染色H.E.200х

圖6 淋巴結(jié)炎 免疫組織化學(xué)染色H.E.400х

3 討論

本次試驗(yàn)所選4只病犬年齡均小于3個(gè)月，屬于急性犬瘟熱感染病例。在肺炎致死的病犬的免疫組織化學(xué)結(jié)果可以觀察到在肺臟的部分支氣管上皮免疫標(biāo)記呈陽(yáng)性，但是在肺泡中很少觀察到犬瘟熱病毒免疫標(biāo)記陽(yáng)性的細(xì)胞。當(dāng)犬瘟熱病毒感染機(jī)體后，可以增加血管的通透性，破壞機(jī)體免疫組織器官中淋巴細(xì)胞的生成，抑制體液免疫和細(xì)胞免疫作用的發(fā)揮，產(chǎn)生免疫抑制作用，肺臟是動(dòng)物機(jī)體與外界聯(lián)通的臟器，容易受到各種微生物的感染，發(fā)生多種細(xì)菌和犬瘟熱病毒混合感染的情況。同時(shí)，觀察到病犬血液循環(huán)中的細(xì)胞因子的濃度減少，細(xì)因子的分泌合成受到抑制，導(dǎo)致動(dòng)物生理功能紊亂，使動(dòng)物肺炎加劇，最終導(dǎo)致死亡。即動(dòng)物往往死于嚴(yán)重的肺炎，犬瘟熱病毒是導(dǎo)致其死亡的間接因素。這和本觀察到的結(jié)果相吻合，免疫組織化學(xué)觀察結(jié)果顯示，犬瘟熱病死犬的肺臟并不是犬瘟熱病毒繁殖數(shù)量最多的臟器，也就不是最適合作為分離病料的組織臟器。此外，病料組織在處理過(guò)程中也會(huì)釋放一些細(xì)胞毒性因子，在將這些處理材料用于接種細(xì)胞時(shí)，其內(nèi)的細(xì)胞毒性因子產(chǎn)生了不利于細(xì)胞的作用。另有試驗(yàn)表明，在犬瘟熱感染的急性病例中，早期犬瘟熱病毒主要在巨噬細(xì)胞中繁殖，隨后在肺泡二型細(xì)胞和肺細(xì)胞中復(fù)制。組織病理學(xué)觀察結(jié)果表明，在犬膀膚粘膜上皮中可以觀察到病毒包涵體。但是在免疫組織化學(xué)染色結(jié)果并沒(méi)有染出犬瘟熱病毒包涵體。認(rèn)為犬瘟熱病毒包涵體并不都對(duì)犬瘟熱病毒的抗體免疫陽(yáng)性反應(yīng)，有可能是因?yàn)槿翢岵《景w中包括的是大量的病毒元件，這有可能會(huì)阻礙了特殊的單克隆抗體和病毒的抗原的結(jié)合。國(guó)外文獻(xiàn)記錄了使用犬瘟熱病犬的尿液作為臨床診斷犬瘟熱病毒的樣本，確定了犬瘟熱病毒通過(guò)尿液排毒，進(jìn)行傳播的一個(gè)重要途徑。

淋巴結(jié)組織病理學(xué)觀察結(jié)果表明，淋巴結(jié)皮質(zhì)區(qū)T細(xì)胞和B細(xì)胞的消耗，同時(shí)伴隨有淋巴結(jié)髓質(zhì)區(qū)網(wǎng)狀細(xì)胞增生，淋巴小結(jié)消失，由增生的巨噬細(xì)胞和網(wǎng)狀細(xì)胞增生填充，淋巴結(jié)髓質(zhì)中僅殘存少量淋巴小結(jié)，診斷為淋巴結(jié)炎。采用免疫組織化學(xué)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在淋巴結(jié)的皮質(zhì)部淋巴小結(jié)和皮竇中有大量免疫標(biāo)記呈陽(yáng)性的細(xì)胞。其密度和陽(yáng)性反應(yīng)強(qiáng)度均高于其他組織器官，與本實(shí)驗(yàn)觀察到的結(jié)果相一致。B細(xì)胞在淋巴小結(jié)和邊緣被膜下淋巴竇中數(shù)量最多。而T細(xì)胞則主要集中在皮質(zhì)深部的厚層彌散淋巴組織—副皮質(zhì)區(qū)。犬瘟熱抗原物質(zhì)主要聚集在T細(xì)胞聚集的區(qū)域。這與本實(shí)驗(yàn)觀察的結(jié)果相一致，犬瘟熱病毒在感染早期和急性病例中會(huì)主要感染T細(xì)胞和B細(xì)胞，同時(shí)使巨細(xì)胞和淋巴細(xì)胞壞死破裂，造成免疫抑制。

4 結(jié)論

在犬瘟熱急性病例中，淋巴組織是犬瘟熱病毒最好的分離臟器。神經(jīng)組織例如大腦作為常用的犬瘟熱病毒分離材料，但在免疫組織化學(xué)染色和組織病理學(xué)檢查結(jié)果顯示其病變并不明顯。實(shí)驗(yàn)中剖檢的6只臨床急性犬瘟熱病犬全部出現(xiàn)了神經(jīng)癥狀包括：抽搐、后肢癱瘓和共濟(jì)失調(diào)等，但是組織病理學(xué)觀察結(jié)果顯示大腦只出現(xiàn)了輕微的血管套和噬神經(jīng)現(xiàn)象，腦組織免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果沒(méi)有觀察到免疫標(biāo)記陽(yáng)性的神經(jīng)細(xì)胞。國(guó)外實(shí)驗(yàn)研究表明在急性和亞急性病例的感染，在犬的神經(jīng)系統(tǒng)中只有少量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，炎性損傷很少。所以急性病例中，大腦并不是最好的犬瘟熱病毒分離材料。

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