鴉膽子油口服乳液抑制肝癌發生的實驗研究*

李超英 陳文文 王楚盈 楊琳琳 遲 源 張大方

鴉膽子油口服乳液抑制肝癌發生的實驗研究*

李超英 陳文文 王楚盈 楊琳琳 遲 源 張大方

目的：探討鴉膽子油口服乳液對二乙基亞硝胺（DEN）誘導的大鼠原發性肝癌的抑制作用。方法：將大鼠隨機分為正常對照組、模型對照組、鴉膽子油口服乳液組。采用自由飲水和灌胃給DEN的方法誘發大鼠肝癌模型，誘發肝癌第5周開始灌胃鴉膽子油口服液，5次/周，14周后處死大鼠，腹主動脈取血，全自動生化分析儀檢測血清中ALT、AST、ALP、γ-GT和AFP的含量，觀察大鼠肝系數、脾系數、胸腺系數、肝臟表面的癌結節數的變化，并進行影像學檢查。結果：與正常對照組比較，模型對照組肝、脾指數和癌結節數明顯增加，胸腺指數明顯降低（P＜0.01），血清中ALT、AFP、AST、ALP、γ-GT的水平顯著高于正常對照組（P＜0.01）；與模型組比較，鴉膽子油口服乳液顯著降低肝癌大鼠肝指數、脾指數、癌結節數，升高胸腺指數（P＜0.01），血清中ALT、AFP、AST、ALP、γ-GT的水平得到明顯改善（P＜0.01或P＜0.05）。結論：鴉膽子油口服乳液對原發性肝癌具有顯著抑制作用，并且作用機制為多方面。

鴉膽子油口服乳液 二乙基亞硝胺 原發性肝癌 抑制作用

原發性肝癌是我國目前發病率和死亡率極高的惡性腫瘤［1］。中藥治療原發性肝癌已成為常見的手段，且能夠有效防治肝癌患者術后復發，具有改善中晚期肝癌患者的生存質量、延長患者生命等多方面的優勢。鴉膽子油口服乳液是一種上市的新型的純中藥廣譜抗癌制劑，主要用于治療肺癌、肺癌腦轉移、胃癌、肝癌等惡性腫瘤。臨床上常用于介入治療中晚期原發性肝癌［2-3］，本實驗旨在研究肝炎階段肝損傷時應用鴉膽子油口服乳液阻止肝癌發展，降低肝癌的發生率。采用二乙基亞硝胺（DEN）誘導大鼠肝癌模型，探討鴉膽子油口服乳液對原發性肝癌的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 材料

清潔級雄性Wister大鼠45只，體重200～220 g。所有大鼠均購自吉林大學實驗動物中心［合格證號：SCXK-（吉）2011-0004］。7080全自動生化分析儀（日本日立公司），TGL-18C高速臺式離心機（上海安亭科學儀器廠），vivid7彩超儀（美國GE公司）。二乙基亞硝胺（Diethylnirtosamine，DEN），純度99.0%（GC），濃度為0.95 g/mL，25 mL，購自TCI梯希愛化成工業發展有限公司。鴉膽子油口服乳液，通化仁民藥業股份有限公司（批準文號：Z22025315）。丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、門冬氨酸氨基轉移酶（AST）、堿性磷酸酶（ALP）、甲胎蛋白（AFP）、γ-谷胺酰轉肽酶（γ-GT活性）試劑盒購自長春匯力生物有限責任公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組 所有大鼠分籠飼養，每籠5只，飼養3天后，隨機分組，分別為正常對照組、模型對照組、鴉膽子油口服液組。

1.2.2 模型制備 正常對照組：整個過程中均飲用自來水。其余各組：用自來水配制濃度為95 μg/mL的DEN溶液，供實驗組大鼠自由飲用，每天更換1次。連續飲用4周后，改飲一般的自來水4周，再繼續飲含95 μg/mL的DEN溶液；大鼠飲用95 μg/mL的DEN的同時，37 mg/kg灌胃，2次/周，共14周［4-7］。誘癌造模第5周開始給予治療藥物，每周連續5天給藥，持續到14周。14周末次給藥后禁食不禁水12 h后，用20%的烏拉坦麻醉，腹主動脈取血。

1.2.3 血清生化指標檢測 取血液分離出血清，用全自動生化分析儀檢測血清中ALT、AST、ALP、γ-GT、AFP的含量［8-10］。

1.2.4 臟器系數的測定 解剖取出肝臟、脾臟、胸腺，用生理鹽水洗凈吸干后稱重，計算臟器指數。即臟器指數=臟器體重（mg）/體重（g）；并記錄肝表面的結節數。

1.2.5 影像學檢測 大鼠腹部剪毛處理，用彩超儀對大鼠肝臟進行掃描。彩超檢測條件：深度5 cm，探頭頻率8.0 MHz。

1.3 統計學處理

采用SPSS 13.0統計軟件分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠肝臟、脾臟、胸腺系數和癌結節數的差異

與正常對照組比較，模型對照組大鼠肝臟、脾臟、胸腺系數和癌結節數均有顯著性差異（P＜0.01）；與模型組比較，鴉膽子油口服乳液組肝系數、脾系數有顯著性差異（P＜0.05），胸腺指數、肝癌結節數有極顯著性差異（P＜0.01，表1）。

2.2 對大鼠血清中ALT、AST、ALP、γ-GT、AFP的影響

與正常對照組比較，模型對照組ALT、AST、ALP、γ-GT、AFP水平顯著高于正常對照組（P＜0.01）；與模型對照組比較，鴉膽子油口服乳液組ALT、AST、ALP明顯低于模型組（P＜0.05），γ-GT、AFP水平與模型組比較有極顯著性差異（P＜0.01，表2）。

2.3 影像學檢查

模型對照組檢出0.40 cm×0.35 cm的腫瘤，還有大小不一、多個結節存在，實質回聲粗糙（圖1，2）。鴉膽子油口服液組檢出0.20 cm×0.18 cm的腫瘤，被膜較模型組光滑（圖3，4）。

表1 鴉膽子油口服乳液對大鼠肝、脾、胸腺系數和癌結節數目的影響 （±s，n=10）Table 1 Effects of BJOOE on the liver index,spleen index,thymus index,and number of nodules in rats

表1 鴉膽子油口服乳液對大鼠肝、脾、胸腺系數和癌結節數目的影響 （±s，n=10）Table 1 Effects of BJOOE on the liver index,spleen index,thymus index,and number of nodules in rats

表2 鴉膽子油口服乳液對大鼠血清中ALT、AST、ALP、γ-GT、AFP的影響 （n=10）Table 2 Effects of BJOOE on the levels of ALT,AST,ALP,γ-GT,and AFP of serum in rats

圖1 模型組大鼠肝臟Figure 1 Images of rat livers of the control group

圖2 彩超示模型組大鼠肝臟Figure 2 Ultrasound images of rat livers of the model group

圖3 鴉胞子油口服乳液組大鼠肝臟Figure 3 Images of rat livers of the model group

圖4 彩超示鴉胞子油口服乳液組大鼠肝臟Figure 4 Rat liver's ultrasound images of treatment group

3 討論

DEN是一種亞硝胺類化合物，具有中毒劑和致癌劑的雙重作用，其靶器官主要是肝臟，應用DEN誘發的大鼠肝癌模型，其誘癌的過程與人類相似，經歷肝炎→肝硬化→肝癌，對人類臨床治療將起到指導作用，也是較理想的適合影像學和分子生物學研究的動物模型［11］藥物，且具有致癌率高，對肝臟致癌專一性強的特點，是實驗研究中最常用的誘癌劑［12］。本實驗采用自由飲用和強制灌胃的方法，能有效提高誘癌率。根據預實驗結果，在造模的第4周，肝臟會出現損傷，肝邊緣呈現黑色狀態。第4周時肝炎出現。第12周時肝臟表面出現粟粒狀結節，質地變硬，此時達到肝硬化階段。到第14周，肝臟表面比較粗糙，遍布大小不等灰白色結節，會出現血性腹水，為腫瘤結節破裂出血所致。所以在第4周末第5周初時開始給予藥物抑制肝癌形成。

原發性肝癌由于肝細胞或肝內膽管上皮細胞發生癌變，又稱為肝細胞癌。DEN誘發的大鼠肝癌模型多為結節型肝癌，癌結節呈球形或分葉狀，灰白色質較軟，散在肝臟表面。鴉膽子油口服乳液干預組癌結節數明顯減少，肝表面較模型組光滑，表明鴉膽子油口服乳液可抑制肝癌的發生，減少癌結節的生成。

彩超檢查是目前臨床上常用的診斷方法，李超英等［13］已經對小鼠原位肝癌移植模型采用彩超技術隊模型進行評價，確定彩超檢查是一種無創診斷和可對原位肝癌檢測的可行性檢測方法。本研究從影像學上清晰可見肝臟上的腫瘤大小及數量，模型組檢出率為100%。

ALT、AST、ALP存在于肝細胞內，當肝臟受到損傷時，大鼠血清中的ALT、AST、ALP的含量升高，升高程度與肝臟的損傷程度呈正比，是檢測肝功能的常用指標。本實驗中模型組ALT、AST、ALP的含量顯著升高，表明肝損傷嚴重；而鴉膽子油口服乳液能顯著改善肝功能。

AFP主要在胚胎的肝臟中合成，出生后血清中的AFP逐漸下降，當發生肝細胞癌時，血清中AFP的含量會急速上升，AFP在原發性肝癌診斷中起重要作用［14］。γ-GT只有胎兒及發生原發性肝癌時，才會異常升高，其他腫瘤γ-GT的含量還是正常水平［15］。AFP和γ-GT聯合用于肝癌診斷，其診斷價值得到極大提升。二者聯合也會相互補充，有助于臨床早期診斷肝癌，提高診斷率，降低肝癌的發生率。本實驗結果顯示，模型組和鴉膽子油口服乳液組AFP和γ-GT均升高，高于空白對照組，但是鴉膽子油口服液組明顯低于模型組，結果表明鴉膽子油口服乳液能阻斷DEN對肝細胞的損傷。

另外，本實驗長期給予肝癌模型大鼠鴉膽子油口服液未發現毒副作用，如惡心、嘔吐、腹瀉等癥狀；并且鴉膽子油口服液對大鼠的體重、脾系數和胸腺系數均有顯著影響，其抗癌機制還與增強免疫有關。

總之，本實驗對鴉膽子油口服液抗肝癌和阻止肝癌發生的作用機制進行深入研究，表明該藥對原發性肝癌具有顯著抑制作用，其作用機制抑制肝癌的發生、顯著改善肝功能、阻斷DEN對肝細胞的損傷和增強免疫功能等多方面，本實驗研究也為該藥臨床防治肝癌提供科學依據。

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（2014-04-05收稿）

（2014-05-17修回）

（本文編輯：周曉穎）

Inhibition of primary liver cancer by oral javanica oil emulsion

Chaoying LI,Wenwen CHEN,Chuying WANG,Linlin YANG,Yuan CHI,Dafang ZHANG
Correspondence to:Dafang ZHANG;E-mail:zdf0431@126.com

Changchun University of Chinese Medicine,Changchun 130117,China

This work was supported by the Jilin Provincial Science and Technology Development Projects(No.YYZX201265[Microsoft2])

Objective:This study aimed to investigate the inhibitory effects of Brucea javanica oil oral emulsion(BJOOE)on primary liver cancer induced by diethylnitrosamine(DEN).Methods:Rats were randomly divided into the control group,model group, and BJOOE group.Rats were given free access to water.DEN was administered intragastrically to induce liver cancer in rats.Five weeks later,rats were intragastrically administered with BJOOE for five times per week.The rats were killed after 14 weeks. Abdominal aortic blood samples were collected.The contents of ALT,AST,ALP,γ-GT,and AFP of serum were detected by an automatic biochemical analyzer.The liver index,spleen index,thymus index,and changes in liver cancer nodules of the surface were observed in rats.Changes in the number of liver cancer nodules of the surface were detected by imaging.Results:Compared with the control group,the liver index,spleen index,and number of nodules of the model group significantly increased,whereas the thymus index significantly decreased(P＜0.01).The levels of ALT,AFP,AST,ALP,and γ-GT of serum in the model group were significantly higher than those in the control group(P＜0.01).Compared with the model group,BJOOE significantly reduced the liver index,spleen index,and number of cancer nodules,but increased the thymus index in the liver of rats with cancer(P＜0.01).The levels of ALT,AFP, AST,ALP,and γ-GT of serum in rats with hepatic carcinoma significantly improved(P＜0.01 or P＜0.05).Conclusion:BJOOE could inhibit primary liver cancer,and the underlying mechanisms are complex.

oral javanica oil emulsion,diethylnitrosamine,primary liver cancer,suppression mechanism

10.3969/j.issn.1000-8179.20140530

李超英 博士，教授，博士生導師。研究方向為藥物新型遞藥系統和新藥研究。

長春中醫藥大學（長春市130117）

*本文課題受吉林省科技發展計劃項目（編號：YYZX201265）資助

張大方 zdf0431@126.com

E-mail：chaoying_li@126.com