康復(fù)1號(hào)對(duì)小鼠成骨細(xì)胞增殖的影響

趙德春吳紹長(zhǎng)邢葆平李曉一

1浙江省武義縣婦幼保健院 武義 322300 2浙江省麗水市第二人民醫(yī)院 3浙江省立同德醫(yī)院

康復(fù)1號(hào)對(duì)小鼠成骨細(xì)胞增殖的影響

趙德春1吳紹長(zhǎng)2邢葆平3李曉一3

1浙江省武義縣婦幼保健院 武義 322300 2浙江省麗水市第二人民醫(yī)院 3浙江省立同德醫(yī)院

目的觀察康復(fù)1號(hào)提取物對(duì)小鼠成骨細(xì)胞MC3T3-E1細(xì)胞增殖的影響。方法將稀釋成不同梯度濃度的康復(fù)1號(hào)提取物和成骨樣細(xì)胞MC3T3-E1共同體外培養(yǎng)，采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞的增殖。結(jié)果康復(fù)1號(hào)提取物低濃度組（1:2000）對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞增殖無(wú)影響（P＞0.05）；中濃度組（1:1000）對(duì)細(xì)胞增殖影響明顯，增殖率48.1%（P＜0.05）；高濃度組（1:250）增殖率68.1%（P＜0.01）。結(jié)論體外實(shí)驗(yàn)表明，康復(fù)1號(hào)能明顯促進(jìn)小鼠MC3T3-E1細(xì)胞的增殖。

小鼠；骨質(zhì)疏松癥；MC3T3-E1細(xì)胞；康復(fù)1號(hào)

骨質(zhì)疏松是由多種原因引起的一種全身性骨骼疾病。目前我國(guó)骨質(zhì)疏松患者8400萬(wàn)人，占總?cè)丝诘?.6%[1]。成骨細(xì)胞是骨質(zhì)形成過(guò)程中的重要細(xì)胞，在預(yù)防骨質(zhì)疏松中起重要作用。康復(fù)1號(hào)是本院的協(xié)定處方，由煅龍骨、煅牡蠣、熟地黃、淮山藥、茯苓、淫羊藿、骨碎補(bǔ)等中藥組成。多年臨床應(yīng)用顯示，康復(fù)1號(hào)對(duì)骨質(zhì)疏松有較好的療效。本研究以小鼠成骨細(xì)胞MC3T3-E1為細(xì)胞模型，通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)的方法，觀察康復(fù)1號(hào)提取液對(duì)成骨細(xì)胞增殖的影響。

1 材料與方法

1.1材 料 中藥材由浙江中醫(yī)藥大學(xué)飲片廠提供；5.3-（4，5）-二甲基-2-噻唑-（2，5）-苯基溴化四氮唑鹽（MTT）粉劑購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；0.25胰酶消化液和細(xì)胞培養(yǎng)基（DMEM培養(yǎng)基）購(gòu)于美國(guó)GIBCO公司；PAA胎牛血清購(gòu)于上海微科生物有限公司。細(xì)胞株及細(xì)胞培養(yǎng)MC3T3-E1細(xì)胞由浙江大學(xué)傳染病研究所提供。

1.2方 法

1.2.1藥物制備 各味藥材按處方劑量（煅龍骨、煅牡蠣各24g，熟地黃、淮山藥、茯苓各9g，淫羊藿12g，骨碎補(bǔ)9g等）配伍后搗碎過(guò)20目篩，取100g加水回流提取3次（1h/次），濃縮配成相當(dāng)于生藥材大約1g/mL的儲(chǔ)備液，經(jīng)0.45um微膜過(guò)濾、除菌，置4℃保存?zhèn)溆?。?shí)驗(yàn)時(shí)用無(wú)血清DMEM依次按梯度稀釋成終濃度為1:250、1:1000、1:2000。

1.2.2實(shí)驗(yàn)方法 以Mosmann建立的MTT比色法[2]，檢測(cè)細(xì)胞增殖。將成骨樣細(xì)胞MC3T3-E1接種于培養(yǎng)瓶中，置于5%CO2分壓、飽和濕度、37℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)傳代。待傳代至第3代時(shí)，取其生長(zhǎng)旺盛的MC3T3-E1成骨樣細(xì)胞，將成骨樣細(xì)胞加入到4%胎牛血清成骨樣細(xì)胞培養(yǎng)基中，配制成濃度為5×104個(gè)/mL的懸液，再接種于成骨樣細(xì)胞培養(yǎng)板，貼壁生長(zhǎng)24h后加入不同梯度濃度的康復(fù)1號(hào)提取物，每個(gè)濃度4個(gè)復(fù)孔。于37℃，5%二氧化碳培養(yǎng)箱48h后，每孔加入30μL MTT溶液（2mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)4h，吸凈上清液，每孔加入二甲基亞砜（DMSO）150μL，振蕩5～15min，使MTT還原產(chǎn)物結(jié)晶完全溶解，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定每孔光密度殖（A值），波長(zhǎng)定于570nm。測(cè)得等體積的細(xì)胞孔的吸光值為對(duì)照，將不同濃度的加藥組與對(duì)照組進(jìn)行比較，細(xì)胞增殖率計(jì)算公式：增殖率=（實(shí)驗(yàn)組-對(duì)照組）/對(duì)照組× 100%

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用（） 表示，采用單因素方差分析，各組間增殖率比較采用卡方檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

康復(fù)1號(hào)提取物和MC3T3-E1細(xì)胞共孵育48h后，低濃度組（1:2000）對(duì)細(xì)胞增殖無(wú)影響（P＞0.05）；中濃度組（1:1000）對(duì)細(xì)胞增殖影響明顯，增殖率48.1%（P＜0.05）；高濃度組（1:250）增殖率68.1%（P＜0.01）。隨著藥物濃度的增加，對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞增殖的影響也明顯加大，各劑量組兩兩比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。見(jiàn)表1、圖1。

表1 康復(fù)1號(hào)提取物對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞增殖的影響（）

表1 康復(fù)1號(hào)提取物對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞增殖的影響（）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

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圖1 各濃度康復(fù)1號(hào)提取物共孵育后MC3T3-E1細(xì)胞生長(zhǎng)圖

3 討論

骨質(zhì)疏松癥是以骨質(zhì)量丟失以及骨組織退變?yōu)樘卣鞯墓谴x疾病，成骨細(xì)胞在骨重建過(guò)程中具有重要作用[2]。MC3T3-E1細(xì)胞株是日本學(xué)者KODAMA等在1981年從新生C57BL/6小鼠顱蓋骨中分離培養(yǎng)建株的成骨細(xì)胞株。該細(xì)胞株具有體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞的各種生物學(xué)特性，包括堿性磷酸酶（ALP）活性、I型膠原合成和基質(zhì)鈣化等成骨細(xì)胞的生物學(xué)特性，常作為骨代謝研究的細(xì)胞模型[4]。

中醫(yī)認(rèn)為，腎主骨、生髓藏精，為先天之本，腎精的盛衰對(duì)骨骼的生長(zhǎng)代謝有密切關(guān)系。腎精足則骨髓之生化有源，骨髓充，骨骼得到髓的充分滋養(yǎng)則骨骼堅(jiān)。腎精虧，骨髓生化不足，髓腔空虛而不能營(yíng)養(yǎng)骨骼，腎虛精髓不充，骨失所養(yǎng)為其主要病機(jī)。根據(jù)“腎主骨”理論，應(yīng)用仙茅配伍加減補(bǔ)腎陽(yáng)，強(qiáng)筋骨，對(duì)骨質(zhì)疏松癥有較好的治療效果，其中淫羊藿具有增強(qiáng)骨形成和降低骨吸收的雙重作用。骨碎補(bǔ)總黃酮能明顯提高去卵巢大鼠骨密度，同時(shí)具有調(diào)整血清IL-4、IL-6、TNF-α水平的作用，IL-6、TNF-α等細(xì)胞因子能夠促進(jìn)破骨細(xì)胞（OC）的骨吸收。骨碎補(bǔ)提取物還能抑制OC性骨吸收[5-6]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，康復(fù)1號(hào)能明顯促進(jìn)MC3T3-E1成骨細(xì)胞增殖，在不同的藥物濃度的作用下對(duì)成骨細(xì)胞的增殖有明顯變化及影響?？稍鰪?qiáng)成骨細(xì)胞活性,加速成骨細(xì)胞的增殖與分化，使骨量增加，從而明顯促進(jìn)骨修復(fù)和骨形成，這可能是康復(fù)1號(hào)治療骨質(zhì)疏松癥的部分機(jī)制。

［1］詹前進(jìn).骨質(zhì)疏松的診斷與治療之進(jìn)展［J］.醫(yī)療保健器具，2001，（2）：183-188.

［2］Mosmann T.Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival：application to proliferation and cytotoxicity assays［J］.J ImmunolMethods，1983，65（1-2）：55-63.

［3］孟繁浩，熊志立，陶勝宇，等.成骨細(xì)胞的生物學(xué)特征及其調(diào)控活性物質(zhì)［J］.化學(xué)與生物工程，2005，（11）：8-10.

［4］Kodama H，Amagai Y，Sudo S，et al.Establishment of a clonal osteogenic cell line from newborn mouse calvaria［J］. Jpn J Oral Biol，1981，23（4）：899-901.

［5］姜向沖，劉敏如.補(bǔ)腎復(fù)方膠囊含藥血清對(duì)成骨細(xì)胞增殖、分化和礦化功能的影響［J］.成都中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，（01）：46-50.

［6］于海濤，鞠成國(guó)，章琦，等.狗脊生、制品不同提取部位對(duì)成骨細(xì)胞的影響［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2011，17（24）：36-39.

Effect of Herb Rehabilitation No.1 on Mouse Osteoblast Proliferation

ZHAO Dechun1,WU Shaochang2,XING Baoping3,LI Xiaoyi. 1 Zhejiang wuyi maternity care,Wuyi (322300),China;2 The Second People's Hospital of Lishui City;3 Tongde Hospital of Zhejiang Province

ObjectiveTo observe the effect of rehabilitation No.1 herb extracts on the proliferation of MC3T3-E1 cells.MethodsOsteoblast-like MC3T3-E1 cells were cultured in vitro with different concentrations of herb extracts of rehabilitation No.1.Cell proliferation was detected by using MTT method.ResultsLow concentration group（1:2000）of the rehabilitation No.1 herb extract had no effect on the proliferation of MC3T3-E1 cells;the proliferation rate was 48.1%in middle concentration group（1:1000）（P＜0.05）;and the proliferation rate of high concentration group（1:250）was 68.1%（P＜0.01）.ConclusionRrehabilitation No.1 herb extracts can promote the proliferation of MC3T3-E1 cells in vitro.

mice；osteoporosis；MC3T3-E1 cells；rehabilitation No.1 herb extracts

2013-09-24

修回日期：2013-10-20

浙江省中醫(yī)藥科學(xué)研究基金項(xiàng)目（No.2012ZB004）；浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生平臺(tái)重點(diǎn)資助計(jì)劃（No.2012ZDA007）；浙江省醫(yī)學(xué)衛(wèi)生科學(xué)研究基金項(xiàng)目（No.2010KYB133）

李曉一，E-mail：2001life@163.com