HPLC法同時測定紅曲中兩種構型洛伐他汀的含量

汪 靜 杭州市第一人民醫院藥劑科 杭州 310006

HPLC法同時測定紅曲中兩種構型洛伐他汀的含量

汪 靜 杭州市第一人民醫院藥劑科 杭州 310006

紅曲；洛伐他汀；HPLC

紅曲為紅曲菌（Monascus）的發酵產物，古代稱丹曲，是我國傳統中藥，李時珍在《本草綱目》谷部中記載：“紅曲，甘、溫、無毒，主治消食，活血，健脾燥胃，治赤白痢下水谷”[1]。研究表明，紅曲中所含有的洛伐他汀（Monacolin K）具有降血脂、降血壓、降低膽固醇等作用[2]，其所含有的Monacolin K具有酸型（開環型）和內酯型（閉環型）兩種結構形式。研究表明，Monacolin K由內酯型結構轉變成酸型結構后，抑制膽固醇生物合成中關鍵酶的能力大約是內酯性的2倍[3-4]，Monacolin K在人體內通常由內酯型水解成酸型，進而起到較好的降血脂效果。然而，在實際應用中Monacolin K的含量也并非越高越好，應該對其進行適量應用。目前，對紅曲中所含有的內酯型Monacolin K含量研究較多，但并不能準確的代表兩種構型Monacolin K的含量。因此，本實驗建立HPLC同時法，對藥材市場上紅曲中所含有的兩種構型Monacolin K含量進行測定，為紅曲的進一步綜合開發利用提供理論基礎。

1 材料與儀器

1.1 材 料 紅曲購于浙江中醫藥大學中藥飲片廠（20120819）。洛伐他汀標準品（批號100601-200502），購自中國藥品生物制品鑒定所）、乙腈（20120311），其它試劑如：甲醇、磷酸等均為分析純。

1.2 儀 器 METTLER TOLEDO AB204-3電子天平（梅特勒托利多電子天平生產廠）；RE-52AA旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）；Agilent1200液相色譜儀（Agilent公司）；色譜柱：ODS-C18柱（250mm×4.6mm×5μm）。

2 實驗方法與結果

2.1 對照品溶液的制備

2.1.1 內酯型對照品溶液的配置 精密稱取標準品（Monacolin K）10.65mg，置于50mL容量瓶中，加入甲醇溶液溶解并稀釋至刻度，超聲溶解30min，冷卻，搖勻。制成0.213mg/mL的對照品儲備液。精密吸取對照品儲備液5.0mL于25mL容量瓶中，加甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，制成濃度為42.6ug/mL的對照品溶液，備用。

2.1.2 酸型對照品溶液的配置 精密稱取標準品（Monacolin K）10.00mg，置于50mL容量瓶中，加4mL甲醇溶解，然后加20mL 0.2mol/L氫氧化鈉溶液[5-8]，超聲30min，冷卻，用3mol/L磷酸調節pH至6左右[5]，加甲醇定容，稀釋至所需濃度即可。該方法不僅所需時間短，而且洛伐他汀（內酯型Monacolin K）完全轉化為酸型Monacolin K，見圖1。

2.2 樣品溶液的制備 精密稱定紅曲樣品0.30g，置于50mL錐形瓶中，加20mL甲醇提取，超聲1h，冷卻，抽濾，濃縮、定容至10mL容量瓶中，加入甲醇至刻度。取樣品溶液，離心10min后（3000r/min），用0.45μm微孔濾膜過濾，待測。

2.3 檢測條件的選擇 通過全波段掃描[9]，得出波長在230nm～254nm下對照品的吸收峰相對較大，對230、238、254nm波長下的對照品進行測定，得出在238nm波長下所測得目標成分峰面積最大，因此，本實驗選取238nm作為本實驗的檢測波長。

實驗選取常用流動相乙腈-0.2%磷酸（80:20）為流動相，流速為1.0mL/min，進樣量為20μL，柱溫為室溫。

2.4 內酯型和酸型Monacolin K的定性測定 取內酯型Monacolin K標準溶液進樣測定，進樣20μL，所測目標成分在6.582min處有唯一吸收峰，見圖1。取處理好的酸型Monacolin K對照品溶液，所測得目標成分在4.465min處有唯一吸收峰，見圖2。

圖1 酸型Monacolin K對照品的色譜圖

圖2 內酯型Monacolin K對照品的色譜圖

2.5 標準曲線的建立 分別精密移取0.213mg/mL的對照品溶液1.0、2.0、5.0、10.0和15.0mL，各置于25mL容量瓶中，加甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，得到濃度分別為8.52、17.04、42.60、85.20和127.80μg/mL的對照品，檢測波長為238nm，進樣量為20μL。以Monacolin K的含量X為橫坐標，吸光值y為縱坐標，繪制標準曲線，得線性回歸方程：y=65152x+15793，r= 0.9999，表明Monacolin K在8.52-0.17280μg/mL范圍內呈良好的線性關系。

2.6 精密度測定 取“2.1.1”制備的Monacolin K標準溶液，進樣20μL，在238nm波長下檢測，連續測定5次，所測5次峰面積的RSD=1.45%，精密度實驗符合要求（＜3%），表明儀器的精密度良好。

2.7 穩定性試驗 取同一供試品溶液，分別測定放置0、30、60、120、180、240min后，分別進樣20μL，在238nm波長下檢測（以內酯型Monacolin K計算）。所測得6次峰面積的RSD= 1.73%，表明該方法重現性良好。

2.8 加樣回收率實驗 取已知濃度的樣品，分別加入高、中、低三種濃度的洛伐他汀標準溶液（以內酯型Monacolin K計算）進行加樣回收試驗，計算回收率，結果平均回收率為98.81%，RSD為0.27%（n=9），表明方法的準確性良好，方法可行。結果見表1。

表1 Monacolin K加樣回收率試驗結果（n=9）

2.9 樣品中Monacolin K計算及含量測定 內酯型Monacolin K濃度=（內酯樣品面積/標品面積）×標樣濃度；酸型Monacolin K濃度=（酸樣品面積/標品面積）×標樣濃度×1.0445；樣品中總Mnacolin K%=（內酯型濃度+酸型濃度）/樣品濃度×100%；因每一分子酸型Mnacolin K比內酯型Monacolin K多一分子水，故應乘以系數酸型結構分子量與內酯型結構分子量之比1.0445。

取紅曲按“2.2”項下方法制備供試樣品溶液，按“2.3”項下色譜條件進行測定，記錄色譜圖（見圖3），記錄峰面積，結合標準曲線及內酯型和酸型Monacolin K濃度的計算方法，計算樣品含量，本實驗測得內酯型Monacolin K含量為0.46mg/g，酸型Monacolin K含量為0.19mg/g，本品紅曲中內酯型Monacolin K占了兩種Monacolin K的70.77%。

圖3 紅曲樣品的HPLC色譜圖：1酸型峰；2內酯型峰

3 討論

酸型結構Monacolin K不穩定，容易脫水形成Monacolin K內酯型結構，不宜作為標準品，本方法用Monacolin K內酯型結構作為標準品，對水解形成的Monacolin K酸結構進行定性和定量，再用它們對樣品進行定性和定量分析。酸型Monacolin K的標準樣品可以通過內酯型Moancolin K（Lovastatin）的標準品制取。本實驗中的HPLC檢測條件對Monacolin K的兩種形態都有很好的分離效果。酸型Monacolin K的出峰時間約為4.4min，內酯型Monacolin K的出峰時間約為6.5min。

干燥的固體紅曲樣品可以近似認為沒有水分存在。而Monacolin K在甲醇中的離解常數非常小，遠小于在水中的離解常數。因而用甲醇萃取時基本上不存在Monacolin K兩種形態發生互變的情況，所以能真實反映原樣品中Monacolin K兩種形態的比例。能很好的杜絕一些廠家將洛伐他汀參入紅曲中的不良行為，適用于保健食品紅曲的分析。

隨著Monacolin K檢測方法的改進，桔霉素檢測方法的建立，紅曲產品質量的不斷提高，功能性紅曲作為保健食品和藥品的一個新領域，將會為人類的健康事業做出更大的貢獻。

［1］李鐘慶，郭芳.紅曲菌的形態與分類學［M］.北京：中國輕工業出版社，2003：20-23.

［2］Pastrna L，Blanc PJ.Production of Cit rinin byMonascus Ruber Submerged Cult ure in Chemically Defined Media［J］.Acta Biotechnol，2006，16（4）：315-319.

［3］ Li H，Morimoto K，Katagiri N，et al.A Novel B-N-Acetylgluosaminidase of Clostridium paraputrificum M-21 with High Activity on hitobiose［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2002，60（4）：420-427.

［4］張哲峰，劉鐵鋼，張冬.羥甲基戊二酰輔酶A還原酶抑制劑的研究進展［J］.中國現代應用藥學雜志，1999，6（16）：1-4.

［5］Ordovas JM.Genediet interaction and plasma lipid response to dietary intervention［J］.Curr Atheroscler Rep，2001，3（3）：200-208.

［6］杜方鳴，于燕梅，李洲，等.高效液相色譜法分離測定洛伐他汀及其酸酸［J］.分析測試技術與儀器，2003，2（9）：95-97.

［7］廖一民，向世學.高效液相同時測定保健食品中兩種結構形式洛伐他汀的含量［J］.中國衛生檢驗雜志，2006，16（3）：286-288。

［8］Roman K，Vladimir K.Determination of lovastatin（mevinolin）and mevinolinic acid in fermentation liquids［J］.J Chromatogr，1998，630：415-419.

［9］王春娜.HPLC法檢測功能紅曲中的洛伐他汀［J］.北京農學院學報，2010，15（2）：48-51.

2013-09-23