姜黃素對急性肺栓塞大鼠NF-κB影響的研究

張 微 王靈聰 浙江中醫藥大學第一臨床醫學院 杭州 310006

姜黃素對急性肺栓塞大鼠NF-κB影響的研究

張 微 王靈聰 浙江中醫藥大學第一臨床醫學院 杭州 310006

目的 研究姜黃素（CUR）對急性肺栓塞（APE）大鼠肺組織中核轉錄因子kappa B（NF-κB）的影響。方法 48只SD大鼠隨機分成對照組、假手術組、模型組和CUR治療組，每組12只。使用自體血栓復制的方法制備APE大鼠動物模型，栓塞后6、24h各組隨機取大鼠6只，水合氯醛麻醉后分別取肺組織行病理檢查：Western blot檢測NF-κB表達水平，免疫組化染色檢測NF-κB陽性細胞數。結果 肺組織病理證實典型APE的血栓和肺泡壞死出血，CUR能減輕肺組織的病理改變。免疫組化染色可見在肺泡細胞、支氣管上皮細胞、支氣管平滑肌以及巨噬細胞周圍均有不同程度的NF-κB表達。栓塞后6、24h，CUR治療組NF-κB陽性細胞計數顯著低于模型組（P＜0.01），接近對照組和假手術組。栓塞后6、24h時，Western blot檢測結果顯示，CUR治療組NF-κB蛋白表達水平低于模型組（P＜0.01），接近對照組及假手術組。結論 CUR可通過下調APE大鼠肺組織中NF-κB表達水平改善其肺部損害，這可能是其干預APE的作用機制之一。

大鼠；肺栓塞；姜黃素；NF-κB

急性肺栓塞（acute pulmonary embolism，APE）是由于內源性和外源性栓子堵塞肺動脈主干或分支引起肺循環障礙的臨床和病理生理綜合征，其病死率僅次于心肌梗死和腫瘤[1]。美國1979年—1999年住院患者中，肺栓塞（PE）的發病率為0.4%。美國每年有30萬人死于APE，居死亡原因的第三位[2-4]。根據法國一項社區研究，PE的發生率為6.0/10 000[5]。大面積、亞大面積的肺栓塞預后較差，有報道稱診斷后30天、1年和3年的病死率分別為13%、26%和35.3%[6]。在前期的研究中[7]，我們采用姜黃素（curcumine，CUR）治療肺栓塞已取得一定的療效。核轉錄因子Kappa B（NF-κB）在各類細胞中廣泛存在，參與調控多種生理及病理過程，在未受刺激的情況下，以無活性的形式存在。目前對于APE后NF-κB的變化及CUR的干預作用的報道極少，本文觀察經CUR干預后，APE大鼠肺組織NF-κB的表達情況及CUR的療效，并研究其可能的作用機制。

1 實驗材料

1.1動 物 SPF級雄性SD大鼠，購自無錫江南實驗動物場，動物合格證號：SCXK（蘇）2009-0005。

1.2藥物和試劑 CUR由上海麗臣生物科技有限公司提供，規格20mg/支，批號110823。Western blot：NF-κB-P65抗體（ab7970）購于Abcam公司；β-Actin抗體（sc-47778）購于Santa Cruz公司；羊抗兔IgGHRP二抗（BS13278）購于Bioworld公司；羊抗小鼠IgG-HRP二抗（BS12478）購于Bioworld公司。免疫組化試劑：兔多克隆NF-κB抗體由Bioworld公司提供，配制成1:200工作液；SP免疫組化染色試劑盒，由福州邁新生物技術有限公司提供。

2 實驗方法

2.1制備動物模型及CUR治療 48只雄性成年SPF級SD大鼠（體質量約200g），根據IBM SPSS19.0統計軟件得出的隨機數表將大鼠分為正常對照組、假手術組、APE模型組和CUR治療組，每組12只。采用自體血栓復制法[7-8]制備大鼠APE動物模型，具體方法：從大鼠自身眼眶靜脈取血制成0.5mL血栓混懸液（約15～20個血栓）置于2mL注射針筒內，并迅速注入到右頸總靜脈內，當大鼠明顯發紺、呼吸加深加快，則表明APE造模成功[9]。正常對照組不予任何處理，假手術組則將等量生理鹽水注入右頸總靜脈內。手術前1天以及40min前分別對各組大鼠按設計進行灌胃：CUR治療組給予CUR（濃度為100mg/kg）2mL，余各組予等量生理鹽水。模型建立后6、24h，CUR治療組給予2mL CUR（濃度同上）灌胃，正常對照組、假手術組和模型組均采用等量生理鹽水灌胃。栓塞后6、24h分別從各組中隨機各取6只大鼠，分別取肺組織檢測各項指標。所有大鼠均在屏障環境下飼養，溫度20～26℃，晝夜交替時間12h/ 12h，相對濕度40%～70%。實驗期間，動物死亡率約20%，死亡的大鼠予補充。

2.2肺組織病理學檢查 取大鼠肺組織用10%甲醛固定24h后用石蠟包埋切片，再行HE染色，最后由病理專科人員顯微鏡檢查。

2.3Western blot[1]分析NF-κB蛋白表達 分取左肺上葉，將少量組織置于勻漿器中，剪碎。加入500μL含PMSF的單去污劑裂解液于勻漿器中勻漿，使組織碾碎。再將裂解液移于1.5mL離心管中，在4℃的溫度下裂解30min，12 000rpm離心10min，取上清測定蛋白量，并于-70℃條件下保存。準備SDS-聚丙烯酰胺凝膠，待測樣品蛋白的加樣量為40mg/20μL/孔，電壓為100V，電泳分離。把分離出來的蛋白條帶轉到NC膜上，然后用含1.0%BSA的TBST封閉液封閉約1h。再加入稀釋的NF-κB和β-Actin抗體，室溫下孵育1h。洗膜后加入稀釋的二抗，并溫和振蕩1h。化學發光顯影，據Image J軟件分析得到抗體與抗原相結合的NF-κB及β-actin特異性條帶的光密度值，并計算出NF-κB與β-actin光密度的比值。

2.4免疫組化染色測定肺組織表達的NF-κB陽性細胞數 光鏡下，每張肺片隨機取3個不重疊的視野。每只大鼠各觀察4張肺片計數陽性細胞，共得到12個數值，取平均值為一只大鼠的結果。

2.5統計學方法 數據以均數±標準差（）表示，使用SPSS19.0統計軟件，采用隨機區組設計的方差分析，P＜0.05表示差異有統計學意義。

3 實驗結果

3.1各組大鼠肺組織病理 正常對照組與假手術組的肺組織無病理改變。模型組栓塞后6h見肺血栓、肺泡壁壞死和肺泡出血，有輕度至中度中性粒細胞及單核巨噬細胞浸潤。CUR治療組肺組織的病變較模型組減輕，肺泡壁輕至中度充血，伴輕度中性粒細胞及單核巨噬細胞浸潤。栓塞后24h肺組織病理，模型組有輕度中性粒細胞以及單核巨噬細胞浸潤，而CUR治療組病變較模型組減輕。

3.2各組大鼠肺組織NF-κB陽性細胞數 免疫組化染色結果顯示，肺組織中NF-κB陽性細胞表達呈棕褐色的顆粒，在肺泡細胞、支氣管上皮細胞、支氣管平滑肌以及巨噬細胞周圍均有不同程度的表達。栓塞后6、24h，模型組NF-κB陽性細胞數顯著高于正常對照組（P＜0.01），CUR治療組顯著低于模型組（P＜0.01），見表1。

表1 各組大鼠肺組織NF-κB陽性細胞數比較（） 個

表1 各組大鼠肺組織NF-κB陽性細胞數比較（） 個

注：與正常對照組比較，*P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.01

3.3各組大鼠肺組織NF-κB表達水平 Western blot結果顯示，栓塞后6、24h，模型組NF-κB蛋白表達水平顯著高于正常對照組（P＜0.01），CUR治療組顯著低于模型組（P＜0.01），見表2。

表2 各組大鼠肺組織NF-κB表達水平比較（）

表2 各組大鼠肺組織NF-κB表達水平比較（）

注：與正常對照組比較，*P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.01

組別正常對照組假手術組APE模型組CUR治療組n/只6666 6h 2.25±0.93 3.11±0.75 8.52±0.05* 2.38±0.42△24h 0.52±0.02 0.54±0.02 0.70±0.04* 0.65±0.03△

4 討論

肺栓塞屬中醫“胸痹”、“喘證”、“血證”、“痰飲”等范疇。其主要病因病機是氣虛、血瘀、痰濁，治療原則是補氣、祛瘀、化痰。姜黃是CUR的母體，是中醫臨床常用藥，具破血行氣、祛瘀止痛功效，可治療氣滯血瘀型肺栓塞。我們前期研究中采用相同的大鼠APE模型，并使用不同劑量的CUR進行治療，結果顯示CUR 100mg/kg的劑量能較好地改善APE大鼠的肺損傷[7]，故本實驗中姜黃素濃度配制為100mg/ kg。

研究表明[10]，APE存在肺動脈以及其分支的阻塞，可引起一系列炎癥反應。NF-κB可使炎癥過程放大和持續。目前已發現多種NF-κB的抑制劑，然而它們副反應較多，故未能在臨床上得以普及[11]。有研究表明[12]，小青龍湯、六君子湯、麻杏石甘湯等以補氣、化痰為主的中藥方劑可抑制NF-κB的活性。而現代研究也發現CUR有抑制炎癥反應之作用，能抑制多種細胞因子的表達。由此我們推想，CUR是否可通過抑制NF-κB的活性從而發揮抑制炎癥反應的作用？本實驗中肺組織病理檢查提示典型的APE血栓及肺泡壞死出血等病理表現，表明該動物模型制備成功。經CUR治療的肺組織病變減輕、炎性細胞浸潤減少，提示CUR能夠改善APE大鼠肺的病理損傷，能有效治療APE大鼠。栓塞后肺組織NF-κB蛋白表達水平定性、定量檢測結果顯示，栓塞后6h及24h CUR治療組NF-κB的陽性細胞計數明顯低于模型組，接近正常對照組和假手術組。栓塞后6h和24h時，Western blot結果也支持這一點。上述結果表明，肺栓塞后NF-κB起一定的介導作用，參與APE后細胞因子的表達調控，而CUR通過抑制NF-κB轉錄因子的表達而起治療作用。我們既往研究發現，APE大鼠存在多種炎癥因子，CUR能夠抑制APE大鼠IL- 1β、IL-8及TNF-α等的表達水平[7,13]。故我們推測，APE后栓子進入肺動脈，繼而引起血管壁內皮細胞的機械損傷、缺血缺氧，促使NF-κB活化，繼發炎癥反應，促進局部產生炎癥因子如IL-1β、IL-8、 TNF-α等，而加重肺損傷[14-16]。而CUR通過抑制NF-κB轉錄因子，從而抑制IL-1β、IL-8、TNF-α等炎癥介質的表達，破壞炎癥的級聯反應，改善APE的肺部損害。

CUR可通過抑制APE大鼠肺組織中NF-κB轉錄因子的表達水平，破壞其炎癥的級聯反應，進而改善APE大鼠肺組織損傷，這可能是其干預APE的機制之一。

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Effects of Curcumine on NF-κB in Acute pulmonary Embolism Rats

ZHANG Wei,WANG Lingcong.The First Affiliated Clinical Medical College,Zhejiang University of Traditional Chinese Medicine,Hangzhou(310006),China

Objective To study the effects of curcumine（cur）on NF-κB in lung tissues of rats with acute pulmonary embolism（APE）.Methods Forty-eight SD healthy rats were randomly divided into 4 groups:control group, sham group,APE model,and curcumine group,with 12 rats in each group.APE model was made by autologous blood clot.At 6 h and 24 h after embolism,6 rats from each group were sacrificed to recover lung tissues for pathological examination and immunohistochemical staining of NF-κB positive cells and western blot of NF-κB expression.Results Typical thrombus and alveolar hemorrhage necrosis were seen in the pathological examination of APE rats,and curcumine reduced the damage.Immunohistochemical results showed that different levels of NF-κB were expressed in macrophages,bronchial epithelial cells,bronchial smooth muscle,and alveolar cells.At 6 h and 24 h after embolism,the count of NF-κB positive cells was obviously fewer in curcumine group than that in model group（P＜0.001）,and was not significantly different between curcumine group and control and sham groups.The level of NF-κB protein in the lung tissue was lower in curcumine group than that in model group（P＜0.01),but did not differ between curcumine group and control and sham groups.Conclusion Curcumine can lessen the damage to the lung in APE rats by inhibiting the expressions of NF-κB.

rats;pulmonary embolism;curcumine;NF-κB

2013-09-30

浙江省自然科學基金資助（No.LY12H29005）

通迅作者：王靈聰，E-mail:wlc501@139.com