基于TCGA數據分析CX43表達在膠質瘤中的臨床意義及其與免疫細胞浸潤的關系

鄭建濤，楊 勇，周 東，*

(1．華南理工大學醫學院，廣東 廣州510006；2．廣東省人民醫院/廣東省醫學科學院，廣東廣州510080)

膠質瘤是最常見的原發性顱內惡性腫瘤，占腦腫瘤的50%左右。目前針對膠質瘤標準的治療方案主要為最大安全范圍的手術切除聯合術后放療和化療，但是在標準治療方案下，膠質瘤患者的預后依然不佳，5年生存率約為10%。2016版WHO中樞神經系統腫瘤分類首次將分子病理類型納入膠質瘤病理診斷，其中異檸檬酸脫氫酶(isocitrate dehydrogenase，IDH)突變、1號染色體短臂和19號染色體長臂(1p/19q)共缺失的患者預后較好，是膠質瘤重要的預后指標。然而不同分子病理分型膠質瘤的發生機制尚未完全明確，因此探索其中潛在的基因差異表達具有重要意義。

連接蛋白43(connexin 43，CX43)是重要的連接蛋白之一，以縫隙連接或半通道的形式參與腫瘤微環境的調節。在膠質瘤領域，目前在基礎試驗中發現CX43的表達增加可促進腫瘤細胞生長及侵襲。然而關于

CX43

基因與神經膠質瘤臨床病理特征及免疫微環境間的報道較少。本文旨在利用生物信息學的方法探索

CX43

基因表達與膠質瘤病理特征、預后的關系及其在腫瘤免疫微環境中的作用。

1 材料與方法

1.1 樣本來源

通過癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas，TCGA，https://portal.gdc.cancer.gov/)下載TCGA膠質瘤患者RNA-Seq表達譜數據及臨床相關數據。剔除數據不完整的部分樣本，最后納入分析的病例共592例，其中低級別膠質瘤(lower grade glioma，LGG)組包含WHO II級和III級共449例，IV級為膠質母細胞瘤(glioblastoma multiforme，GBM)組共143例。

同時回顧性收集廣東省人民醫院神經外科2019年4月—2020年4月膠質瘤患者術后石蠟標本切片及臨床信息共34例。

1.2 實驗方法

1.2.1 評價

CX43

基因在具有不同病理特征的膠質瘤患者中的表達情況

按LGG及GBM組別、IDH突變情況和1p/19q是否共缺失狀態比較膠質瘤患者中CX43 mRNA的表達情況。

1.2.2 評估

CX43

基因表達對膠質瘤預后的影響

以

CX43

基因表達水平的中位數為界限進行分組，大于等于中位數者列為CX43高表達組，低于中位數者列為CX43低表達組。使用Kaplan-Meier生存分析曲線圖，應用log-rank檢驗方法比較

CX43

基因高表達組及低表達組的預后差異。

1.2.3 基因集富集分析

基因集富集分析(gene set enrichment analysis，GSEA)是一種計算方法，對輸入基因集的組間差異進行排序，從而確定其在不同生物學功能及信號通路中的富集情況。將膠質瘤標準化的mRNA數據集分為CX43高、低兩個表達組。在GSEA(4.1.0)版本中，選擇“h.all.v7.2.symbols.gmt”注釋基因集、表型標簽選擇“高表達或低表達”，置換次數選擇1 000次。結果中歸一化富集分數(normalized enrichment score，NES)＞1.5、名 義 上(nominal，NOM)

P

＜0.05且錯誤發現率(false discovery rate，FDR)

q

＜0.25被認為差異具有統計學意義。

1.2.4

CIBERSORTx

免疫浸潤分析

CIBERSORTx(https://cibersortx.stanford.edu/)是由Alizadeh實驗室和Newman實驗室開發的一款分析工具，用于估算基因表達譜，并使用基因表達數據估算混合細胞群體中成員細胞類型的豐度。首先，將標準化的mRNA數據集上傳到CIBERSORTx上，利用網頁分析工具，選擇排列置換次數1 000次，可得到22種免疫細胞在各樣本中的含量。進而比較CX43高、低表達組間各種免疫細胞的成分。

1.2.5 臨床樣本免疫組化染色

石蠟標本切片，脫蠟水化，微波抗原修復、3%雙氧水阻斷，10%山羊血清封閉，CX43一抗(購自博士德公司，貨號BA1727，按1∶150稀釋)4℃孵育過夜，復溫漂洗后孵育二抗、漂洗后使用DAB顯色劑顯色、蘇木素復染、脫水晾干后封片，顯微鏡觀察。同法檢測M2樣巨噬細胞分子標志CD163，其中CD163一抗購自Abcam公司，抗體按1∶500稀釋。CX43免疫組化結果判讀，根據免疫組化的染色強度將無明顯染色計為0分，淺黃色計為1分，棕黃色計為2分，棕褐色計為3分。然后按染色面積評為：≤10%為0分，10%～25%(含)為1分，25%～50%(含)為2分，50%～75%(含)為3分，＞75%為4分。兩項評分相乘為最終評分，評分≤6分為CX43低表達組，＞6分為CX43高表達組。M2樣巨噬細胞分子標志CD163免疫組化結果判讀，在顯微鏡下評估CD163陽性腫瘤相關巨噬細胞的數量。隨機選擇5個高倍鏡視野(×400倍)，將每個高倍視野的標記細胞計數后，取平均數代表該樣本中CD163陽性M2樣巨噬細胞的浸潤數量。

1.3 統計學方法

使用R語言4.0.0版本進行統計分析并作圖。組間連續變量比較使用Student's

t

檢驗，組間率的比較使用卡方檢驗。以

α=

0.05為檢驗水準。

2 結果

2.1 CX43 mRNA表達與膠質瘤臨床病理特征的關系

CX43 mRNA的表達水平在LGG及GBM組間比較差異無統計學意義(圖1A)。在IDH突變型組中CX43 mRNA的表達水平顯著低于IDH野生型組(圖1B，

P

＜0.01)。1p/19q無共缺失組中CX43 mRNA的表達水平較共缺失組顯著升高(圖1C，

P

＜0.01)。

圖1 CX43 mRNA表達水平與各臨床病理特征的關系

2.2 CX43表達與膠質瘤患者預后的關系

Kaplan-Meier生存分析提示CX43 mRNA低表達組在膠質瘤中具有更好的預后(圖2，

P

＜0.01)。

圖2 CX43 mRNA表達水平與膠質瘤患者生存率的關系

2.3 CX43相關的GSEA富集分析

CX43

基因高表達組利用GSEA分析在9個特征基因集中富集(NOM，

P

＜0.05；FDR，

q

＜0.25)(表1)。其中與免疫相關的通路包括了白細胞介素-2(inteleukin 2，IL-2)/信號轉錄與激活因子5(signal transducer and activator of transcription 5，STAT5)信號通路、白細胞介素-6(inteleukin 6，IL-6)/Janus激酶(Janus kinase，JAK)/信號轉錄與激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)信號通路、炎癥反應等通路。結果提示

CX43

基因高表達對膠質瘤的作用與免疫浸潤相關。

表1 GSEA富集分析

2.4 CX43 mRNA高、低表達組間免疫細胞的豐度差異

比較CX43 mRNA高、低表達組中22種免疫細胞豐度的差異(圖3)，結果提示幼稚CD4 T細胞、濾泡輔助性T細胞、活化NK細胞、巨噬細胞M0表型在CX43低表達組比高表達組升高，差異均具有統計學意義(

P

＜0.05)。而在CX43 mRNA高表達組顯著升高的為單核細胞、巨噬細胞M2表型、活化樹突狀細胞。

圖3 CX43 mRNA高、低表達組間免疫細胞的豐度差異

2.5 免疫組化分析結果

免疫組化檢測CX43蛋白在具有不同臨床病理特征的膠質瘤患者間的表達水平見圖4，結果提示1p/19q有、無共缺失和M2樣巨噬細胞標志物CD163細胞數在CX43蛋白高、低表達組間存在差異。1p/19q無共缺失的比例及M2樣巨噬細胞(CD163細胞)數在CX43蛋白高表達組中增加(

P

＜0.05，表2)。

表2 免疫組化檢測CX43蛋白在具有不同臨床病理特征的膠質瘤患者間的表達差異

圖4 膠質瘤組織中CX43及CD163表達情況的免疫組化檢測結果

3 討論

目前對膠質瘤的認識已經從原有的組織病理診斷過渡到分子病理診斷，IDH突變、1p/19q共缺失等分子標志物被用于膠質瘤的診斷、預后評價及治療，但膠質瘤的治療效果仍不佳，中位生存期為20～36個月。因此利用生物信息學對公共數據庫的分析挖掘，可發現新的膠質瘤差異基因，有助于未來膠質瘤的診斷和治療。

CX43蛋白在人體所有細胞中均有表達，是維持細胞正常生理功能的重要蛋白，負責相鄰細胞間或與細胞外環境的物質傳遞，其中包括重要的信號分子和細胞代謝產物。隨著對CX43研究的深入，其在腫瘤中的作用被不斷發現，CX43蛋白高表達與黑色素瘤、原發性膽管癌的不良預后相關，

CX43

基因的過表達促進乳腺癌及黑色素瘤的遠處轉移。CX43對膠質瘤的作用集中在基礎試驗及免疫組化檢測CX43的表達與膠質瘤臨床特征方面。

CX43

基因表達水平與膠質瘤臨床分子病理特征及預后的研究較為少見。本文通過對TCGA數據庫的生物信息分析及臨床病理標本免疫組化的結果提示，CX43 mRNA在IDH野生型及1p/19q無共缺失組中高表達，且生存分析中提示

CX43

基因高表達組的總體生存期更短。既往的研究表明IDH野生型膠質瘤對放化療的反應較IDH突變型差，其無進展生存期及總體生存期均顯著縮短。同樣，1p/19q無共缺失的患者其中位生存期明顯縮短。可見

CX43

基因高表達與膠質瘤預后較差的分子病理分型相關，這可能是

CX43

基因高表達生存預后更差的原因之一。Hong等發現膠質瘤細胞與星形細胞可利用CX43形成縫隙連接，傳遞microRNA促進膠質瘤的侵襲性，而在沉默

CX43

基因表達后可消除該作用。另外CX43的表達可使膠質瘤細胞對替莫唑胺的化療形成耐藥性，從而促進腫瘤進展。這提示IDH野生型、1p/19q無共缺失的膠質瘤可能通過CX43高表達對化療產生抵抗，從而影響患者的預后，而以CX43為靶點的治療方法可能是未來膠質瘤治療的重要途徑之一。基于GSEA分析的結果提示CX43 mRNA高表達的膠質瘤與IL-2、IL-6、炎癥免疫通路富集，而CIBERSORTx分析結果提示CX43 mRNA高表達的膠質瘤M2型巨噬細胞的比例增高。已知腫瘤免疫細胞浸潤對腫瘤的生長起促進作用，尤其是M2型巨噬細胞可釋放相關免疫因子促進腫瘤細胞的生長，而與之對應的M1型巨噬細胞具有殺傷腫瘤的作用。故將M2型巨噬細胞極化為M1型巨噬細胞或抑制巨噬細胞向M2表型極化是免疫治療中攻克惡性腫瘤的突破點。IL-6是巨噬細胞向M2表型極化的因子之一，在胰腺導管腺癌中，IL-6是誘導巨噬細胞向M2表型極化的信號因子。另外，在卵巢癌中被證實減少IL-6的表達可以通過JAK/STAT3信號通路抑制巨噬細胞向M2表型的轉化。在膠質瘤的研究中M2型巨噬細胞的增多可促進腫瘤細胞生長，而使用綠原酸可將M2型巨噬細胞重新極化為M1型巨噬細胞，從而抑制膠質瘤生長。結合本文結果提示，CX43的高表達可能通過IL-6/JAK/STAT3信號通路調控膠質瘤微環境中巨噬細胞向M2表型極化，使M2型巨噬細胞增多從而導致腫瘤的進展及不良預后。而針對

CX43

基因的治療可能成為改善膠質瘤免疫微環境的治療手段，值得進一步研究。綜上所述，通過對TCGA數據庫的分析及臨床標本驗證，提示CX43高表達與1p/19q無共缺失狀態相關，

CX43

基因高表達為膠質瘤不良預后的指標。且CX43高表達與IL-6免疫通路相關并伴隨M2型巨噬細胞增多提示CX43高表達可能為巨噬細胞向M2表型極化的促進因素。后期針對CX43與巨噬細胞M2表型極化作用的分子機制的研究，可能是對膠質瘤治療新的探索方向。