兩種瓜類細菌性果斑病菌快速檢測技術的比較及應用

郭玉層，潘俊鵬，哈小菲，方黎，方勇，米娜瓦爾·艾克拜爾

新疆維吾爾自治區農業廳哈密植物檢疫工作站，新疆哈密 839000

兩種瓜類細菌性果斑病菌快速檢測技術的比較及應用

郭玉層，潘俊鵬，哈小菲，方黎，方勇，米娜瓦爾·艾克拜爾

新疆維吾爾自治區農業廳哈密植物檢疫工作站，新疆哈密 839000

以瓜類細菌性果斑病菌菌懸液田間和調運檢疫抽樣檢查時采集的病組織為試材，比較免疫凝聚試紙條和瓜類細菌性果斑病菌核酸檢測試劑盒檢測的靈敏度和適應性。兩者各有優缺點，前者具有簡便、快速、易操作特點，適用于田間快速檢測和診斷；后者靈敏度較高，特異性更好，需要較長時間和儀器輔助，適用于室內檢測。

瓜類；細菌性果斑病菌；免疫凝聚試紙條；瓜類細菌性果斑病菌核酸檢測試劑盒

瓜類細菌性果斑病是西瓜和甜瓜上最重要的毀滅性種傳病害，其病原為嗜酸菌屬西瓜種（Acidovoraxavenaesubsp.citrulli,簡稱A.a.c），屬世界性檢疫病害，主要危害西瓜、甜瓜果實，產生大量病斑并造成果實腐爛，嚴重時有的地塊甚至100%發病，毀田絕收[1]。目前，使用抗病品種是防治果斑病最根本、最有效的措施，但是迄今并沒有發現對果斑病免疫或高抗的品種[2]。雖然化學藥劑處理可以減少種子的帶菌量,但不能從根本上起到防治細菌性果斑病的作用。因此快速而準確地檢測病原物是有效進行病害防治的基礎和前提。免疫凝聚試紙條檢測是利用抗原—抗體之間特異性結合原理的血清學技術[3]。瓜類細菌性果斑病菌核酸檢測試劑盒（恒溫擴增-試紙法）將病原體DNA擴增、核酸雜交和核酸試紙條檢測三種技術有機地融為一體，在反應中加入西瓜細菌性果斑病菌特異性引物和特異性探針，一次性完成病原體的擴增及雜交過程，然后用一次性核酸檢測裝置對西瓜細菌性果斑病菌感染進行定性檢測。

本文探討西甜瓜細菌性果斑病菌快速檢測技術免疫凝聚試紙條法和瓜類細菌性果斑病菌核酸檢測試劑盒（恒溫擴增-試紙法）在田間和調運檢疫過程中的應用及推廣。

1 材料與方法

1.1 供試材料

待檢病甜瓜采自哈密市淖毛湖鎮8批、大南湖鎮2批，在煙墩聯合檢疫檢查站隨機抽樣檢驗的樣品28批，調自廣西、云南的西瓜各2批，調自鄯善縣的甜瓜2批，調自吐魯番的甜瓜1批，調自哈密市淖毛湖鎮的甜瓜4批，調自五家渠市的甜瓜4批，調自昌吉的西瓜3批。A.a.c菌株由新疆出入境檢驗檢疫局技術中心提供。

免疫檢測試紙條，瓜類細菌性果斑病菌核酸檢測試劑盒（恒溫擴增-試紙條法）（以下簡稱核酸檢測試劑盒）。

1.2 病組織預處理及菌株的菌懸液配制

挑取供試菌株的單菌落，于KB培養基28℃恒溫箱中培養2～3d，用無菌水配制成濃度約1× 108cfu/mL的菌懸液備用[4]。將田間采集和煙墩所抽樣品的西甜瓜病組織用酒精棉球進行表面消毒，再用滅菌小刀切下，并分別一分為二，其中一份浸于免疫凝聚試紙條配套的樣品浸泡緩沖液袋中進行充分的研磨待測，另一份用滅過菌的研缽分別磨碎，并加入適量核酸檢測試劑盒中提供的0.1×TE緩沖液（以能完全浸泡病組織為宜）浸泡備用。

2 檢測結果與分析

2.1 免疫凝聚試紙條檢測

用商品化A.a.c專化型免疫凝聚試紙條檢測將1.2中配制的A.a.c菌懸液和組織浸泡液。打開試紙條包裝袋，取出試紙條，插入菌懸液和組織浸泡液中，浸泡深度不超過試紙條規定的示意線；5 min后取出試紙條，用吸水紙吸干并觀察。觀察陽性對照時，對照線和檢測線會在3～5min內出現，表明檢測結果為陽性；在觀察檢測無菌DDH2O和PBS緩沖液做的空白對照(陰性對照)時，免疫凝聚試紙條只出現一條對照線，表明檢測結果為陰性；在檢測瓜病組織浸泡液時，只出現對照線，沒有檢測線出現，表明檢測結果為陰性；這說明檢疫人員采集的瓜樣品和抽樣檢驗的瓜樣品中無瓜類細菌性果斑病發生。如果沒有對照線出現，表明該試紙條檢測結果無效。

2.2 瓜類細菌性果斑病菌核酸檢測試劑盒檢測

將1.2中制備的A.a.c菌懸液和瓜病組織浸泡液按核酸檢測試劑盒中操作步驟進行樣品處理及DNA的提取，恒溫擴增和檢測，并在規定時間內判讀結果。利用核酸檢測試劑盒檢測A.a.c菌懸液陽性對照時，質控線和檢測線會在10min內出現，表明檢測結果為陽性；在檢測DDH2O水和緩沖液做的空白對照(陰性對照)中的試劑盒中試紙條只出現一條質控線，表明檢測結果為陰性；在檢測瓜病組織浸泡液時，只出現質控線，沒有檢測線出現，表明檢測結果為陰性；這說明檢疫人員采集的瓜樣品和抽樣檢驗的瓜樣品中無瓜類細菌性果斑病發生或者瓜類果斑病菌的細菌拷貝數低于試劑盒最低檢測限。若檢測線強度較弱時，將檢測線強度與色卡進行對照：≧L4，為陽性，＜L4為陰性。無紅色線條出現為無效，表明核酸試紙條失效或一次性核酸檢測裝置損壞。

2.3 兩種方法檢測效果的比較

免疫凝聚試紙條和核酸檢測試劑盒檢測A.a. c菌懸液和西甜瓜病組織浸泡液各有特色和適應性(表1)。

免疫凝聚試紙條檢測是利用抗原-抗體之間特異性結合原理的血清學技術，A.a.c菌株的蛋白質作為抗原與試紙條中的特異性抗體結合，通過顯色反應來表示菌懸液或病組織浸泡液的檢測結果，因此這種方法的特異性一般，靈敏度較低(106cfu/mL)，但投入成本低，操作簡易，在田間地頭都可檢測，而且所用時間極短，只需5min左右，適合田間快速診斷病害[4]。

核酸檢測試劑盒是將病原體DNA擴增、核酸雜交和核酸試紙條檢測三種技術有機地融為一體，在反應中加入瓜類細菌性果斑病菌特異性引物和特異性探針，一次性完成病原體的擴增及雜交過程，然后用一次性核酸檢測裝置對瓜類細菌性果斑病菌感染進行定性檢測。因此這種方法的特異性較高，靈敏度較高(103～104cfu/mL)，投入成本也較高，且需少量的試劑和儀器設備才能完成檢測，其操作簡單易行，單個樣品的檢測所需時間約2h，適合室內快速檢測和相關研究使用。而且其中運用了玻璃化DNA聚合酶保存技術實現了試劑盒的常溫運輸，密閉的一次性核酸檢測裝置有效避免了擴增產物氣溶膠擴散造成的污染和假陽性。

表1 兩種方法檢測A.a.c的效果比較

3 小結與討論

本文將免疫凝聚試紙條和瓜類細菌性果斑病菌核酸檢測試劑盒應用于田間快速檢測和調運檢疫快速檢測中，并將兩種檢測方法作了對比分析。結果表明，免疫凝聚試紙條檢測的靈敏度為106cfu/mL，并有簡便、快速、易操作等特點，適合于田間病害快速檢測和診斷;瓜類細菌性果斑病菌核酸檢測試劑盒應的檢測靈敏度為103～104cfu/mL，比免疫凝聚試紙條提高了100～1000倍，效率高，特異性更好，但需要時間較長2h，而且需要一定的儀器設備，適用于常規實驗室的室內快速檢測。

免疫凝聚試紙條和瓜類細菌性果斑病菌核酸檢測試劑盒的商業化及其推廣應用，為瓜類細菌性果斑病的田間快速檢測和病害早期的診斷和預防控制提供了技術條件，具有重要的實際應用價值，尤其是將兩項技術結合運用于植物調運檢疫的快速檢測，首先用免疫凝聚試紙條進行瓜類細菌性果斑病菌的快速檢測和初步篩選，檢出為陽性后再用瓜類細菌性果斑病菌核酸檢測試劑盒進行確定，這樣大大提高了西、甜瓜的調運檢疫效率和瓜類細菌性果斑病菌的檢出率。

[1]周黎，張炳坤，冶海林，等.新疆瓜類細菌性果腐病的發生與病原鑒定[J].蔬菜,2013（3）:64-67.

[2]閻莎莎，王鐵霖，趙廷昌.瓜類細菌性果斑病研究進展[J].植物檢疫，2011，25（3）:71-76.

[3]聞慧，劉興洋，李國英,等.甜瓜細菌性果斑病菌檢測技術研究進展[J].安徽農業科學,2007,35(20):6182-6185.

[4]馮建軍，許勇，李健強,等.免疫凝聚試紙條和TaqMan探針實時熒光PCR檢測西瓜細菌性果斑病菌比較研究[J].植物病理學報,2006,36（2）:102-108.

郭玉層（1976年—），新疆阿勒泰人，農藝師，主要從事植物檢疫的工作。

2013－12－08