綠鰭馬面鲀ERα基因部分cDNA序列克隆及其表達研究

趙梅琳,溫海深,張冬茜,何 峰,李吉方

(中國海洋大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院,山東 青島 266003)

綠鰭馬面鲀(Navodon septentrionalis)屬鲀形目(Tetraodontiformes)革鲀科(Aluteridae),馬面鲀屬(Navodon),英文名 Bluefin leatherjacket,俗稱面包魚、象皮魚、馬面魚等[1]。主要分布于日本、朝鮮半島,非洲東岸,南非以及中國的東海、黃渤海和臺灣海峽,其中東海是中國 綠鰭馬面鲀產(chǎn)量最大的海區(qū)[2]。20世紀80年代以前,綠鰭馬面鲀是中國海洋捕撈居第二位的重要經(jīng)濟魚類[3]。近些年,由于自然海域資源嚴重衰退,加之肉質(zhì)鮮嫩,肝臟營養(yǎng)價值高,綠鰭馬面鲀的市場價格明顯提高,綠鰭馬面鲀凍魚片、烤魚片等諸多產(chǎn)品暢銷國內(nèi)外,市場前景十分廣闊[1]。

雌激素參與調(diào)節(jié)生殖、骨骼以及腦的發(fā)育,是一種重要的性類固醇激素。研究表明,雌激素在體內(nèi)的重要生理功能是由雌激素受體介導(dǎo)的,包括核受體介導(dǎo)的基因組效應(yīng)和膜受體介導(dǎo)的非基因組效應(yīng)[4-6]。雌激素受體(Estrogen receptors,ER)是核受體超家族成員之一,其蛋白的分子結(jié)構(gòu)大致劃分為六大功能結(jié)構(gòu)域：A/B區(qū)為轉(zhuǎn)錄激活區(qū)、C區(qū)為DNA結(jié)合區(qū)、D區(qū)為鉸鏈區(qū)、E區(qū)為配體結(jié)合區(qū)和F區(qū)[7]。雌激素受體在哺乳動物中有兩個基因亞型,分別為雌激素受體α(ERα)和雌激素受體β(ERβ)。由于魚類中發(fā)生了一個額外的基因復(fù)制事件,一些研究報道了上述兩種亞型的變體。在虹鱒(Oncorhynchus mykiss)[8]、金魚(Carassius auratus)[9]、倒刺 (Spinibarbus denticulatus)[10]等硬骨魚類中均發(fā)現(xiàn)了兩種 ERα亞型,而在斑馬魚(Danio rerio)[11]、尼羅羅非魚(Oreochromis niloticus)[12]、許氏平鲉(Sebastes schlegeli)[13]等硬骨魚類中均只發(fā)現(xiàn)一種 ERα。從目前的研究來看,不同種類的雌魚、雄魚的 ERα顯示出不同的組織表達模式。在性成熟倒刺 和尼羅羅非魚中,性腺、肝臟、腎臟和腦中均檢測到 ERα的分布[10,12]: 金魚中,垂體的表達量最高,性腺、肝臟、腸、腦中均有較高的表達[9]: 許氏平 鲉中,ERα在雌魚中有豐富的表達,在卵巢、肝臟、腸、脂肪、腎臟、腦、心、胃、脾、頭腎中均有較高表達,而雄魚中只在精巢和肝臟檢測到較高表達[13]。目前,國內(nèi)外對綠鰭馬面鲀分子生物學(xué)的研究甚少,關(guān)于其雌激素受體的研究尚未見報道。

作者克隆了綠鰭馬面鲀ERα基因核心序列,采用半定量方法分別檢測了其在雌魚、雄魚多個組織中的表達情況,并采用實時定量RT-PCR方法分析其在卵巢和精巢組織中的周年表達情況。該項研究為進一步闡明綠鰭馬面鲀ERα的生理功能提供了科學(xué)依據(jù),同時也為其人工繁育提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2010年11月至2011年9月,從煙臺百佳水產(chǎn)有限公司每2個月采集1次,每次采樣用于本實驗的有3尾雄魚和3尾雌魚,共36尾。實驗魚規(guī)格為體長(20.0～29.5)cm,體質(zhì)量(195.5～648.8)g。實驗魚麻醉后解剖,收集各組織樣品,于–80℃超低溫冰箱保存用于基因克隆和表達,并測定各生物學(xué)指標,包括體質(zhì)量、體長、去內(nèi)臟質(zhì)量、性腺質(zhì)量等。計算性腺指數(shù)(GSI=[性腺質(zhì)量/去內(nèi)臟質(zhì)量]×100)。

1.2 總RNA的提取和cDNA的合成

綠鰭馬面鲀各組織總 RNA用 RNAiso reagent(Takara)按照說明書進行提取。分用UV分光光度法(Ultrospec2100Pro,Amersham)和瓊脂糖凝膠電泳進行濃度和完整性檢測。各樣本的1 μL總RNA用隨機引物和反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV(Takara)合成第一鏈。

1.3 ERα的克隆及序列分析

根據(jù)已知魚類的ERα序列,利用CodeHop在線[14]設(shè)計簡并引物,如表1,并以卵巢組織的cDNA為模板進行擴增。所得序列用 DNAMAN軟件推算氨基酸序列,并在 NCBI數(shù)據(jù)庫(http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/)中進行BLAST比對和同源性分析。

表1 綠鰭馬面鲀ERα cDNA克隆及表達所用引物Tab.1 Primers used for Navodon septentrionalis ERα cDNA cloning and mRNA expression analysis

1.4 系統(tǒng)進化樹構(gòu)建

使用Clustal X將其與其他物種ERα氨基酸序列進行多重序列比對,使用 MEGA 4.0鄰接法(Neighbour-Joining,NJ)構(gòu)建系統(tǒng)進化樹[15]。

1.5 ERα的組織表達和周年表達

利用 Primer5.0軟件設(shè)計一對特異性引物tsERαF5和tsERαR5。通過半定量RT-PCR分析ERα在雌魚和雄魚的各組織分布,包括性腺、肌肉、腸、鰓、腎、胃、脾臟、肝臟、心臟、垂體和腦。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min,94℃ 30 s,57℃ 30 s,72℃ 30 s共35個循環(huán),72℃ 10 min,4℃ 1 h。18 S rRNA作為內(nèi)參基因,反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min,94℃ 30 s,57℃ 30 s,72℃ 30 s共25個循環(huán),72℃10 min,4℃ 1 h。PCR產(chǎn)物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳,并用GIS凝膠成像系統(tǒng)3.60軟件(Tanon)分析擴增條帶的光密度。

設(shè)計特異性引物tsERαF4和tsERαR4,運用實時定量qRT-PCR技術(shù)檢測ERα在精巢、卵巢(n=3)中的周年表達情況,并以18S為內(nèi)參基因?qū)?shù)據(jù)進行分析[16]。

1.6 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標準誤表示,并采用 SPSS 13.0軟件進行 ANOVA分析,用 Duncan’s多重比較進行數(shù)據(jù)處理和檢驗分析,當(dāng)P＜0.05時差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 綠鰭馬面鲀雌激素受體ERα cDNA核心序列的克隆

克隆得到綠鰭馬面鲀雌激素受體ERα cDNA核心序列共1410 bp,按照DNAMAN V6的翻譯縱覽確定該序列的翻譯起始位點并進行翻譯,該序列編碼470個氨基酸,如圖1所示。該序列已提交GenBank,登錄號為 JX508794。在綠鰭馬面鲀中,只克隆得到了一種型式的ERα,尚沒有發(fā)現(xiàn)其他亞型。

2.2 ERα基因序列分析與系統(tǒng)進化分析

推導(dǎo)得到的氨基酸序列與其他魚的ERα蛋白序列比對,該序列與其他核受體相似,可以分為6個功能區(qū),如圖 2所示。其中 C區(qū)和 E區(qū)比較保守。C區(qū)有由 8個保守的半胱氨酸殘基組成的兩個鋅指結(jié)構(gòu),并具有高度保守性的 D-box(PATNQ)、P-box(CEGCKA)以及PKA位點(RRKS)。E區(qū)有一個配體依賴的轉(zhuǎn)錄激活區(qū)(AF-2),它在硬骨魚和哺乳動物中都是高度保守的。

圖1 綠鰭馬面鲀ERα cDNA部分序列Fig.1 The partial sequence of Navodon septentrionalis ERα cDNA

用Clustal X軟件將推導(dǎo)得到的氨基酸序列與人(Homo sapiens)、褐家鼠(Rattus norvegicus)、非洲爪蟾(Xenopu stropicalis)、斑馬魚等 13個物種的 ERα序列進行比對。圖 3顯示,硬骨魚類匯為一個分支,哺乳動物和兩棲類匯為另外一 個分枝。綠鰭馬面鲀ERα與黑棘鯛(Acanthopagrus schlegelii)ERα的進化地位最為接近,Blastp比對,兩者的相似度為89%。此外,綠鰭馬面鲀ERα與舌齒鱸(Dicentrarchus labrax)、許氏平 鲉、點帶石斑魚(Epinephelu scoioides)等的進化地位較為接近,其氨基酸相似度分別為88%、87%、86%。與倒刺、金魚等親緣關(guān)系較遠。

2.3 ERα的組織分布

綠鰭馬面鲀ERα在雌魚、雄魚的11種組織間的表達模式不同。從圖4中可以看出,雌魚中,ERα在垂體、心臟、卵巢中的表達量最高,其次為腦、肝臟、胃、腎、肌肉。在脾臟、腸中的表達最較低,而在鰓中沒有檢測到表達: 雄魚中,ERα在垂體、肝臟、腎臟、精巢中的表達量相對較高,其次為腦和腸,在胃、脾臟、心臟、鰓、肌肉中沒有檢測到表達。

2.4 不同性腺發(fā)育期中ERα的周年變化

綠鰭馬面鲀的 GSI隨著性腺發(fā)育呈明顯的周年變化規(guī)律(圖 5A),雌魚 GSI在 11月份出現(xiàn)最低值2.15,之后緩慢上升,在翌年5月顯著升高并達到全年最大值6.30,之后逐漸下降,7月份出現(xiàn)一次顯著性降低4.47(P＜0.05): 雄魚GSI與雌魚呈相似的變化規(guī)律(圖5B),11月出現(xiàn)最低點,為1.30,最高峰同樣出現(xiàn)在5月,為4.73。

綠鰭馬面鲀ERα在卵巢、精巢間呈現(xiàn)不同的周年表達模式(圖6A),卵巢中ERα相對mRNA水平在5月份有最大值1.60,7月份顯著降低,并出現(xiàn)最低值0.72(P＜0.05),之后開始回升。而在精巢中,9月份出現(xiàn)最大值,為1.57,之后緩慢下降,在5月份顯著降低,并達到最低值0.71(P＜0.05,圖6B)。

3 討論

本試驗 克隆得到綠鰭馬面鲀ERα的基因核心cDNA片段共 1410bp,其所推導(dǎo)的氨基酸序列與黑棘鯛同源性最高(89%),且氨基酸序列含有核受體超家族典型的特征：分為6個功能區(qū),C區(qū)和E區(qū)高度保守,且E區(qū)包含AF-2活性功能區(qū)。表明該序列為目的序列。

圖2 綠鰭馬面鲀ERα與其他物種ERα氨基酸序列比較Fig.2 Comparison of amino acid sequences of Navodon septentrionalis ERα with other species

圖3 不同物種的ERα氨基酸構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹Fig.3 Phylogeneticanalysis of the amino acid sequences of ERα

圖4 ERα 在綠鰭馬面鲀雌魚、雄魚的組織表達Fig.4 Tissue distribution of ERα in Navodon septentrionalis by RT-PCR

雌激素受體在生物體內(nèi)廣泛表達,其研究具有重要的生理意義。隨著20世紀80年代首次成功克隆得到人 ERα受體開始[17],其在哺乳動物中的研究逐漸興起。近年來雌激素受體在硬骨魚中的研究較多。據(jù)報道,金魚ERα在垂體中表達信號最強,其他組織次之[9]: 斑馬魚ERα在垂體、肝臟、精巢中表達量較高[11]: 金頭鯛(Sparus auratus)成魚 ERα主要在肝臟和垂體中表達[18]。本研究與上述研究結(jié)果相似,綠鰭馬面鲀 ERα在垂體、肝臟和性腺中也有較高的表達。已有研究顯示,雌激素在中樞神經(jīng)組織中與其受體結(jié)合,對生殖行為、神經(jīng)保護、學(xué)習(xí)記憶等有重要作用[19]:雌激素在性腺和肝臟中與雌激素受體結(jié)合,分別調(diào)控卵黃蛋白原合成相關(guān)基因的表達,進而影響性腺發(fā)育,調(diào)節(jié)生殖行為[10,20,21]。

圖5 綠鰭馬面鲀雌魚、雄魚的GSI周年變化Fig.5 The annual changes of GSI in female and male Navodon septentrionalis

圖6 ERα在精巢和卵巢中的周年表達模式Fig.6 The relative expression pattern of ERα in ovary and testis of Navodon septentrionalis during the annual reproductive cycle

綠鰭馬面鲀?yōu)橹苣戤a(chǎn)卵魚類,一般從 4月中下旬到 6月底為繁殖期[22],人工養(yǎng)殖的雌性綠鰭馬面鲀,其生殖周期與野生綠鰭馬面鲀生殖周期基本一致。綠鰭馬面鲀雌魚GSI在11月有最低值,可能是由于魚體要大量儲存能量用以越冬,只有少量用以性腺發(fā)育所致,與人工養(yǎng)殖半滑舌鰨(Cynoglossus semilaevis)進入12月份后GSI顯著下降相一致[22]。從11月到翌年3月,隨著卵巢發(fā)育,卵黃積累,雌魚的GSI逐漸升高,5月開始進入繁殖期,此時GSI顯著高于 11月(P＜0.05)。與此同時,卵巢 ERα表達水平也逐漸上升并在 5月達到峰值,推測可能由于卵巢發(fā)育后期,卵黃大量積累,必須有大量雌激素參與卵母細胞的發(fā)育,此時雄激素大量轉(zhuǎn)化為雌激素所致[23],已有研究證實,雌激素水平的升高與卵黃生成有關(guān)[24]。之后 GSI逐漸下降,由于卵巢完成排卵并開始退化吸收,在7月份GSI出現(xiàn)一次顯著性降低(P＜0.05),此時卵巢ERα達到全年最低。9月卵巢完成退化吸收進入重復(fù)發(fā)育Ⅱ期,GSI有所降低,卵巢ERα 表達量開始回升。綠鰭馬面鲀雌魚GSI的這一變化規(guī)律與黃鯛(Dentextu mifron)[25]、半滑舌鰨[22]等硬骨魚類的研究結(jié)果一致。Shi等[13]的研究結(jié)果顯示,許氏平 鲉ERα在卵巢發(fā)育成熟時有最高水平,其他時期均保持在較低水平,與本研究中綠鰭馬面鲀卵巢ERα變化趨勢相似。

綠鰭馬面鲀雄魚GSI變化趨勢與雌魚基本相同。其精巢ERα表達水平與GSI沒有直接的相關(guān)性。雄魚GSI在11月出現(xiàn)最低值。隨著精原細胞的分裂分化,精母細胞的逐漸成熟,翌年5月進入繁殖期并達到峰值,此時精巢ERα呈下降的趨勢,并在5月達到最低,可能是由于隨著精巢發(fā)育成熟雌激素含量減少所致。之后隨著GSI的降低,精巢ERα水平上升。據(jù)報道,鰻鱺(Anguilla japonica)、倒刺、許氏平鲉隨著精子生成的全部過程,精巢 ERα表達水平逐漸升高,可以認為雌激素在雄魚精子發(fā)生中是不可或缺的,但其作用機制尚不明確[10,13,26],而許氏平鲉ERα的表達水平是否與其卵胎生這一特殊的繁殖方式有關(guān)尚不十分清楚,同時也不排除對部分魚類特定發(fā)育期,精巢雌激素受體表達研究結(jié)果有互相矛盾的現(xiàn)象[27]。雌激素受體在雄魚中的機理尚不完全了解,有待于進一步研究。

作者首次克隆綠鰭馬面鲀ERα核心cDNA序列,并對其進行了基因結(jié)構(gòu)與進化分析,分別檢測了雌魚、雄魚的組織表達情況,同時還研究了 ERα在綠鰭馬面鲀生殖周期中的表達,為進一步揭示 ERα的生理功能提供科學(xué)依據(jù),同時也為綠鰭馬面鲀的人工繁育提供了一定的理論基礎(chǔ)。

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