條斑紫菜分子生物學研究現狀

沈頌東

(蘇州大學 醫學部基礎醫學與生物科學學院 細胞生物學系,江蘇 蘇州 215123)

條斑紫菜(Porphyra yezoensis Ueda)隸屬于紅藻門(Rhodophyphyta),原紅藻綱(Protoflorideophyceae),紅毛菜目(Bangiales),紅毛菜科(Bangiaceae),紫菜屬(Porphyra)。紫菜屬的種類分布廣泛,目前已報道的種類約有 130多種[1]。我國記錄定名的紫菜物種或變種有22種[2]。條斑紫菜為北太平洋西部特有的種類,主要分布于我國黃、渤海和東海北部沿岸,以及日本列島和朝鮮半島沿岸,是中、日、韓三國共同栽培的種類。紫菜是重要的經濟海藻,目前全世界其栽培年產值為 20億美元,約占整個海藻產業的2/3。我國是紫菜栽培生產的重要國家,2010年度的栽培量按國際標準計算達200億枚(每枚為3g),其中江蘇省生產出來的條斑紫菜就達到 32億枚。世界各國的學者對紫菜的生物學進行了較多的研究,現綜述如下。

1 條斑紫菜生活史

條斑紫菜(P.yezoensis)具有異形的世代交替,即宏觀可見的葉狀孢子體世代和微觀的絲狀孢子體世代交替出現完成其復雜的生活史轉變過程。從僅有幾百個細胞所組成的幼小葉狀體開始,由頂端細胞不斷轉化為單孢子囊,形成、放散單孢子。單孢子為單倍體,所萌發生成的葉狀體仍為單倍體。條斑紫菜雌雄同株,精子囊器淡黃色,呈條紋狀混夾在深紅色的果孢子囊中,整個生殖器官在葉的末梢端形成明顯的深紫和淡黃色相間的條斑狀。其中精子囊器有 128個或 64個精子囊,為♂A4B4C8,也有♂A2B4C8,果孢子囊為 16個果孢子,分裂式為♀A2B2C4。絲狀體為二倍體階段,成熟發生的殼孢子仍為二倍體,殼孢子萌發時經減數分裂形成葉狀體,染色體數目n=3(圖1)[2]。

圖1 條斑紫菜的生活史

2 紫菜的分子生物學研究

對紫菜屬物種開展分子生物學研究早在1993年就已經開始了[3]。主要包括對DNA多態性進行的分子標記研究;對特定的功能進行的基因組學研究和功能基因組學研究。主要目的是測定基因序列以鑒定物種,確定物種之間的親緣關系,關注這些研究的主要是遺傳學和分類學研究者。Stiller等[3]對太平洋東北部一個新種P.rediviva的核糖體小亞基rRNA基因序列(small subunit rDNA,SSU rDNA)以及位于核糖體大小亞基 B/E-基因序列之間的間隔序列(internal transcribed spacer,ITS)進行 RFLP研究,并與其他幾種紫菜進行比較分析后認為該新種與北大西洋的另一種紫菜P.purpurea有很近的親緣關系。

通過國內外對紫菜屬海藻分子標記技術研究獲得的結果可以發現在紫菜屬中具有豐富的遺傳多樣性,可以在今后的物種選育中作為很好的良種來源開展遺傳育種工作。這些遺傳多樣性不一定表現于形態的多樣性,不同種紫菜間具有很接近的外部形態往往是由于平行演化造成的非同源性相似,這對紫菜的系統分類乃至種系發生研究都頗具迷惑性。Niwa等[4]同時運用形態分類方法和 RFLP技術對 1種可能屬于甘紫菜但尚未確定的野生個體進行鑒定分類,兩種結果表明該野生個體屬于甘紫菜,基于SSU rDNA和ITS序列的PCR-RFLP分析結果還表明與條斑紫菜相比具有較遠的遺傳距離。Niwa的研究表明紫菜系統分類僅依靠外部形態特征是不夠的,而將形態與DNA分析兩種手段相結合則可以較好的解決以上問題。He等[5]運用AFLP(amplified fragment length polymorphism)技術對來自同一個絲狀體的兩種葉片,由殼孢子萌發出來的40株和單孢子形成的88株,進行了電泳條帶的比較,發現同一個來源的后代遺傳相似度不高,說明它們之間發生了雜交,單孢子苗的多態性位點的比例高達 98.6%,超過殼孢子苗的 80.7%;而平均遺傳相似度單孢子苗為 0.61,低于殼孢子苗的0.71。

通過測定核酸一級結構中核苷酸序列組成來比較同源分子之間相關性的方法稱為核酸序列分析方法。分子系統學研究中常使用的基因組有三種: 葉綠體基因組、線粒體基因組、核基因組。Shivji[6]在20世紀 90 年代初構建了條斑紫菜葉綠體基因組圖譜并對其結構作了報道,Reith[7]構建了P.purpurea的葉綠體基因組圖譜,發現有 46%的基因為陸生植物所不具備。但由于技術要求以及耗費較大,目前測序主要集中在rbcL、ITS等一些小片段。近年來,隨著DNA 測序技術的迅速發展和日益普及,DNA 測序在遺傳多樣性的研究中正在起著越來越大的作用。Yang 等[8]運用最新的 Solexa測序技術對條斑紫菜的轉錄組進行了大規模的測序,獲得了大量的新基因;牛建峰等[9]對條斑紫菜(P.yezoensis)進行Solexa高通量測序,獲得低覆蓋度全基因組草圖。該基因組草圖大小約 220 Mbp,GC質量分數 53.08%;包含26 629 個預測基因,其中16 409個基因具有內含子,平均每個基因含 2.22 個內含子;基因結構分析表明具有內含子的基因平均長度為 2 214 bp,內含子平均大小 319 bp;代謝通路分析表明嘌呤代謝是含有蛋白數量最多的代謝途徑。這些工作為以后開展功能基因的研究提供了豐富的研究素材。

2011年Shen等[10]利用基因抑制消減雜交(SSH)技術對條斑紫菜配子體和孢子體基因表達譜差異進行了研究。結果表明,選擇果孢子替代絲狀殼孢子作為配子體的材料,并從相同的葉狀體上培養營養細胞(配子體)和果孢子(孢子體)細胞,這樣能將樣品間的差異減少到最低。測序后得到相應克隆的EST(Expressed sequence tag)序列,共有 360個序列已全部提交 NCBI。果孢子的 181個 EST序列號為HS572581- HS572762,營養細胞的179個EST序列號為HS572763- HS572942。將EST進行BLAST分析顯示,共有196條基因,其中果孢子細胞有92條,營養細胞有104條。GO注釋顯示孢子體基因主要定位在細胞質和細胞核(58%);而配子體基因主要定位在質體、高爾基體、核糖體和內質網上。營養細胞主要的生物學功能與 DNA復制/修復、碳水化合物代謝、物質轉運和轉錄,特別是對熱激和對氧化性的應激方面;孢子體世代同樣表達這些代謝過程,尤其在信號轉導、DNA和蛋白質修飾和蛋白質和核苷酸代謝方面。根據 GO注釋的結果發現孢子體世代傾向于生長和自我保護;而孢子體世代在發育上更積極。

He等[11]對條斑紫菜孢子體和配子體的 MicroRNAs進行了比較分析,測序得到的14個miRNAs中只有一個在兩個世代中同時出現,幾個新的miRNAs和其他生物沒有同源性,說明紫菜中可能存在復雜的小RNA形成系統。

對于紫菜屬的功能基因研究目前正處在蓬勃發展的階段,由于在紫菜中轉入外源基因來進行表達存在一定的困難,王金鋒等[12]嘗試將外源基因用玻璃珠法轉入壇紫菜果孢子中,但是要將外源基因穩定表達出來還有很長的路要走。目前主要從紫菜中獲得已知功能的基因在原核生物或者酵母、衣藻等真核生物中表達,以確定其功能。Wang等[13]就是從條斑紫菜中獲得海藻糖 6磷酸合成酶基因轉移到大腸桿菌中表達。Wu等[14]測定了條斑紫菜不同生活周期中的 7個管家基因的表達水平,通過檢測這些基因的絕對表達量,發現 GAPDH的表達量最為穩定適合作為檢測基因表達量的內參基因。張寶玉等[15]克隆了條斑紫菜alternative oxidase (AOX)的全長基因,共1650 bp,ORF為1332 bp,編碼443個氨基酸。通過 qPCR檢測了該基因在生活史個階段的表達水平,發現絲狀體階段的AOX表達量顯著高于葉狀體階段。

功能基因的研究急待加強

核糖體 RNA基因(rDNA)存在于所有的生物中,由一些高度重復序列組成、并有轉錄活性的多基因家族,它在真核細胞中有幾十甚至數千個拷貝,在植物總DNA中約占10%。rRNA基因在真核生物中是高度保守的,它以18S rDNA(small subunit,SSU)、5.8S rDNA和28S rDNA(large subunit,LSU)順序串聯,組成一個基因簇,彼此被內轉錄間隔區(internal transcribed spacer,ITS)序列分開,而轉錄單元之間被基因間間隔區(intergenic spacer,IGS)序列間隔區分開。真核生物rDNA基因簇結構如模式圖所示(圖2)。在每個重復片段中,兩個內部轉錄間隔區 ITS1和ITS2將18S、5.8S和28S分隔開。18S rDNA上游含有一個外轉錄間隔區(ETS),在ITS和ETS中含有 rDNA前體加工信息,相鄰的重復片段之間為非編碼區 IGS隔開, IGS中有促轉錄的增強子,在轉錄時有啟動和識別的作用[16]。

圖2 植物18S～28SrDNA的基本結構示意圖

rRNA的生物學功能在不同的物種中保持一致,成為分子進化的忠實尺度,消除了趨同進化和趨異進化所引起的系統誤差。在進化速率上,編碼區比較保守,可在種、屬、科、目、水平上用于不同生物種的比較。18S rDNA和28S rDNA基因的3′端是高度保守的,即使在原核與真核生物之間也能建立位點同源性。其中,18S比28S基因更保守,5.8S基因僅有160個左右的堿基,最為保守。18S rDNA和28S rDNA基因是系統發育中種及種以上階元的良好標記。rDNA序列由于在不同生物之間既有高度的保守性,又存在一定的序列變異性,已經成為生物分子鑒定和定量檢測中最常用的分子指標[17-18]。

18S rDNA是唯一具有信息分子和功能分子兩種作用的編碼核糖體的基因,為高度重復序列,約800～10000拷貝,在細胞內連續排列。同時18S rDNA基因序列結構、功能十分保守,若它們的序列存在變異就能成為一種穩定的DNA標記,用于鑒別物種。由于18S rDNA區高度保守,主要適合科及以上階元,而18S rDNA的全序列相對較小,更適合PCR擴增和測序,因此已被廣泛的應用于藻類的分子系統學研究[19-20],解決了許多疑難海洋藻類的分類鑒定問題。

由于核糖體大亞基基因 28S rDNA具有高度可變區序列,能為設計 PCR引物或探針提供特異性強的序列,因此被用于區別分類物種之間的親緣關系如屬、種或地理株系等問題。在藻類中28S rDNA編碼區的序列比較分析已多用于分類學和系統發生等方面的研究[21-22]。但目前國內利用核糖體大亞基來探討紫菜屬的系統發育的研究則未見報道。

Broom等[23]對分布于新西蘭沿岸的49個紫菜核糖體的18S rRNA基因序列進行測序分析,結果表明,該區域的紫菜屬植物存在較大的遺傳變異和較遠的種間遺傳距離,這與它們的外部形態特征并不吻合,這很有可能是長期的生殖隔離所致。Kunimoto等[24]對 9種紫菜的 18S rDNA全序列進行了測序分析,SSU rDNA外顯子序列在同種紫菜種內保持一致,體現出很高的保守性,而內含子序列在種內存在差異,并根據內含子的插入與缺失,將它們的rRNA基因結構分為 4種類型,結果表明不同地理居群的同種紫菜其18S 基因結構存在差異。

核糖體 DNA(rDNA)的內轉錄間隔區(ITS)和基因內間隔區(IGS)進化速度快,序列變異豐富,能夠提供比較豐富的變異位點和信息位點。IGS是rDNA中進化速度最快的區域,在已經研究的IGS 序列中,發現 IGS 序列比 ITS序列存在著更多層次的差異,不僅在種間、種內居群間存在著差異性,甚至不同個體之間也存在著差異性[25]。在分子系統學研究中常以ITS或IGS序列作為構建系統進化樹的基礎。

Mizukami等[26]對野生種和栽培種條斑紫菜的ITS序列分析結果表明,野生種和栽培種ITS序列之間存在差異,并且野生種的不同個體間其 ITS序列也存在一定的差異。Niwa[27]對7種栽培品系條斑紫菜的 ITS1 rDNA序列進行了測序分析,結果表明,這7個品系的ITS1序列不存在差異性,因而不適合作為這7個品系的分類鑒定標記。

Kunimoto等[28]對甘紫菜的SSU rDNA和ITS測序結果表明,SSU rDNA外顯子序列在甘紫菜種內保持一致,體現出很高的保守性,而內含子序列在種內存在差異,所以內含子以及ITS1序列可作為遺傳標記進行種內遺傳差異的鑒定,從而建立不同的甘紫菜品系。

在親緣關系較近的物種分類鑒定研究中,當ITS序列存在爭議時,IGS序列可以提供更有力的支持。對栽培稻種內ITS序列研究表明,利用ITS序列能將典型秈粳亞種分開,但親緣關系較近的品種其 ITS序列完全相同。戴小軍等[18]對栽培稻種內IGS序列研究表明,親緣關系較近的品種其 ITS序列完全相同,由于 IGS序列比 ITS序列的信息位點多,基于IGS序列能將亞種內,特別是親緣關系較近的品種區分開。因此 IGS序列更適于亞種內不同品種間遺傳關系的分析。

本實驗室2009年最早在藻類中克隆出了IGS的部分堿基序列,長度達到 1100 bp,在浙江寧波、福建莆田和廣東汕頭栽培的壇紫菜中發現25個堿基的變異,能夠區分這些同一個物種不同地理群之間的品種差異。相關結果發表在 Journal of Applied Phycology上[29]。目前本實驗室又對條斑紫菜的28S rRNA全序列進行了克隆,并獲得了部分IGS堿基序列。2011年年底,Sutherland等[30]15位國際著名的藻類學家在美國的《Journal of Phycology》上發表了一篇文章,以18S rDNA序列和rbcL序列構建系統樹,按照單系起源的原則,將廣義的紫菜屬分成了15個屬,其中葉狀體的 8個屬包括 Porphyra,Pyropia,Wildemania和5個新屬。產自中國沿海的22個物種都屬于 Pyropia屬,但是由于缺乏中國的研究者參與,采集的物種沒有本地區的樣品,需要更多的中國當地的研究工作來提供證據,特別需要 28S rDNA和IGS這樣更易變化的分子序列來確定紫菜物種的親緣關系。

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