近海污染物對海洋浮游植物生長及生化組成影響的比較研究

劉鳳嬌,李順興, ,鄭鳳英, ,黃旭光, ,李艷彩, ,宋 鈺,吳 衍,陳妹貞

(1.南師范大學 化學與環境學院,福建 漳州 363000;2.現代分離分析科學與技術福建省重點實驗室,福建 漳州 363000)

目前,海洋石油烴污染越來越嚴重,污染源主要包括海上作業、陸地、大氣的人為源排放以及自然界排放。石油泄漏事故在世界各地頻發,據估算,全球每年泄漏到大海的石油總量超過1 300 000 t[1-2]。石油烴會通過海洋食物鏈富集,生物體,特別是海洋食品,累積濃度超過健康標準,給人類帶來健康威脅[3-4]。海洋浮游植物生長受石油烴(如0號柴油、萘、1,2,4-三甲苯、氧甲酚、鄰甲苯胺)的影響[5-6]。

土霉素(OTC)是四環素類抗生素,成本低,效力高,廣泛用于海水養殖中細菌性疾病的治療[7-9]。抗生素僅 20%～30%被魚類吸收,70%～80%進入水環境[10-11]。鏈霉素影響淡水浮游藻類小球藻(Chlorella vulgaris)和銅綠微囊藻(Microcystis aeruginosa)生長已被證實[12]。

河口和近岸海域富營養化(即氮和磷濃度超標)已成為嚴重的環境問題[13-14]。海洋生物吸收氮磷遵循Redifield比例 [即n (N)︰n (P)= 16][15]。富營養化顯著影響海洋浮游生物的生長、細胞形狀、細胞干質量和生化組成 (如碳水化合物、蛋白質、葉綠素和堿性功能團)[13,16]。丙二醛(MDA)具細胞毒性,是脂質過氧化反應的終產物之一,也是自由基產生以及組織損傷程度的指示物[17-18]。超氧化物歧化酶(SOD)是含金屬元素的活性蛋白酶,對于活性氧(含超氧陰離子O2?、過氧化氫H2O2、羥基自由基·OH、單線性氧1O2)的歧化作用起催化作用,可為需氧有機體的生存提供保護[18-19]。 氮、磷、石油烴及抗生素等近海常見污染物對自由基的形成、海洋藻體抗自由基機制的研究,迄今未見報道。

威氏海鏈藻是海洋硅藻的模式種之一、優良的開口餌料[20]。作者對比研究了硝酸鹽、土霉素和 0號柴油濃度對威氏海鏈藻生長及生化組成(葉綠素a、蛋白質、MDA含量和SOD活性)的影響,為近海污染物對海洋浮游植物的毒性評價研究提供前期背景數據。

1 材料與方法

1.1 實驗儀器

UV-75602PCS紫外可見分光光度計(上海欣茂儀器有限公司);雙人單面超凈工作臺(蘇州凈化設備有限公司);SPX-300 IC 微電腦人工氣候箱(上海博迅實業有限公司);DM LB2生物顯威鏡(德國,Leica儀器公司);蠕動泵驅動器 Yz2515x(保定蘭格恒流泵有限公司);Milli-Q凈水器(美國,Millipore公司);布萊森-102C超聲波破碎儀(中國布萊森超聲波公司)。

1.2 實驗藥品

硝酸鉀配制N標準儲備液(10 mmol/L);磷酸二氫鉀配制 P標準儲備液(360 mmol/L);氯化銨溶液(4.67 mol/L);No.0柴油儲備液100 mg/L(No.0柴油,購于中國石化加油站);土霉素(0.25 g/片,江西國藥有限責任公司);實驗用去離子水由 Milli-Q離子交換凈水系統處理(電阻率 18 M?cm)。溶液均用去離子水配制。

1.3 藻類培養條件

海水取自東海外海,用0.2 μm濾膜過濾,于4℃下保存 6個月。用銅鎘柱還原法[21]和抗壞血酸還原磷鉬藍法[22]測海水中氮、磷含量,平行測定3次,得海水中氮、磷的背景值分別為1.2、0.2 μmol/L。

威氏海鏈藻來自廈門大學近海海洋環境科學國家重點實驗室,保存于海水中(添加 Na2SiO3·H2O 保持 Si濃度為21.1 mmol/L)。實驗過程中海水P濃度保持在1.0 μmol/L,c(N)分別為 8.0,16.0,32.0,64.0 μmol/L、c(WAFs)分別為 0.1,0.5,1.0,5.0 mg/L、c(OTC)分別為 1.0,3.0,5.0,10.0 mg/L。光照強度 140 μmol/(m2s);光暗比14 h︰10 h;水溫19℃。適當攪拌(100 r/min)海藻懸浮液,模擬海水流動,同時減少WAFs和OTC在容器壁上的吸附。生物平行樣重復測定 3次。每24 h監測培養液中 N、P濃度,適時補充 KNO3和KH2PO4,保持氮磷的濃度和比值不變。

1.4 參數測定方法

顯微鏡計數法測定培養后海藻細胞的藻密度。取藻液100 mL,用0.2 μm濾膜過濾,在暗處冷凍條件下用5 mL 90%丙酮萃取10 h,離心(4 000 r/min)10 min。取上清液,分別在 λ663、λ645、λ630、λ750處測定吸光值,用 λ663、λ645、λ630的吸光值減去 λ750的吸光值,以校正微粒濁度空白的吸光度,將所得數據參照文獻[23]計算葉綠素a含量。

取藻液800 mL,用0.2 μm濾膜過濾,于藻體中加入5 mL磷酸緩沖液(預冷,0.1 mol/L,pH=7.8),在冰浴中用超聲波破碎儀破碎 30 min,勻漿液離心(10 000 r/min)10 min,上清液為粗酶液,采用氮藍四唑光化學還原反應法[24]測SOD活性,硫代巴比妥酸(TBA)法[25]測定MDA含量,考馬斯亮藍法[26]測蛋白質含量。

2 結果與討論

2.1 近海污染物對威氏海鏈藻生長的影響

細胞增長率取決于細胞分裂率。以東海外海海水(c(N)= 1.2 μmol/L,c(P)=0.2 μmol/L)為對照組,據圖1～圖3所示,N、OTC和WAFs均對威氏海鏈藻的生長產生不同程度的影響。添加 OTC,在整個生長周期,藻細胞密度均高于對照組,即起促進作用;添加N,在指數期,藻的生長狀況優于對照組,N起促進效應,在穩定期,卻呈反作用;添加 WAFs,在適應期,有利于藻生長,指數期之后,抑制藻生長。當c(N)、c(OTC)、c(WAFs)分別為 8.0～32.0 μmol/L,1.0～5.0 mg/L,0.1～0.5 mg/L時,細胞密度隨濃度增加而增加;當 c(N)、c(OTC)、c(WAFs)分別為 64.0 μmol/L、10.0 mg/L、5.0 mg/L時,細胞生長受抑制。.

圖1 硝酸鹽添加對威氏海鏈藻細胞密度的影響Fig.1 Influence of N addition on the cell density of T.weissflogii

圖2 0號柴油分散液添加對威氏海鏈藻細胞密度的影響Fig.2 Influence of water accommodated fractions of No.0 diesel oil on the cell density of T.weissflogii c(N)=1.2 μmol/L,c( P)=0.2 μmol/L

圖3 土霉素添加對威氏海鏈藻細胞密度的影響Fig.3 Influence of OTC addition on the cell density of T.weissflogii (n (N)︰n (P)=1.2︰0.2)

添加 WAFs,細胞密度最高值與對照組相比明顯減少,當劑量為5.0 mg/L時,細胞密度僅為對照組的0.3倍。OTC能促進細胞生長,濃度5.0 mg/L作用最大,是對照組的 1.4倍。3種污染物對藻細胞生長毒性影響程度為: WAFs＞N＞OTC,即3者對紡錘體的形成影響不同。3種污染物均使藻的生長周期縮短,除5.0 mg/L WAFs縮短5 d,其他條件下縮短 2～3 d。

2.2 近海污染物對葉綠素a含量的影響

葉綠素是浮游植物進行光合作用的重要物質,葉綠素 a含量可用來估算初級生產力,也是浮游植物生命力的重要表征。葉綠素a是一種色素-蛋白質復合體,氮是其合成的主要合成原料,當培養介質中N缺乏,必然限制藻體中葉綠素a的合成[15]。實驗探究不同濃度N、OTC和WAFs對葉綠素a 含量的影響如圖4所示。

圖4 硝酸鹽、土霉素及0號柴油分散液添加對葉綠素a含量的影響Fig.4 Influence of N,OTC,and WAFs addition on the content of chlorophyll a

當c(N)低于8.0 μmol/L,即氮相對不足,葉綠素a合成受限,葉綠素a 含量最低;當c(N)為32.0 μmol/L時,威氏海鏈藻處于最佳生長狀況,葉綠素 a 含量最高;當c(N)高于32.0 μmol/L時,威氏海鏈藻生長受抑制,對葉綠素合成不利。上述影響與營養鹽濃度對細胞生長和生化組成的影響類似[18]。c(OTC)為1.0～5.0 mg/L能促進藻生長,但濃度為10.0 mg/L抑制藻生長,從而影響藻體中葉綠素a合成。浮游植物能降解石油烴,通過同化作用將 0.1～1.0 mg/L的WAFs做為營養源,促進自身生長,但石油烴濃度過大(5.0 mg/L),影響光合作用和呼吸作用,抑制葉綠素a合成。

3種污染物對葉綠素 a合成影響程度為 N＞OTC＞WAFs,此結果證明 N是葉綠素合成的主要限制因素之一、葉綠素合成與藻的生長狀態密切相關。

2.3 近海污染物對蛋白質含量的影響

N是生理過程的主要參與者,對蛋白質積累和合成起關鍵作用。蛋白質主要是N同化作用產物,其濃度可作為新陳代謝能力和能源供應條件的指示物。硝酸還原酶是NO3-N轉為NH4+N過程中的速率控制酶[27]。谷氨酰胺合成酶是影響蛋白質結構的關鍵酶,可增強N活性,有利于同化作用,從而促進蛋白質合成。

圖5所示,c(N)=16.0 μmol/L時,藻生長狀況最佳,蛋白質含量最高;c(N)＜16.0 μmol/L 時,藻細胞密度增幅較小且提前進入衰亡期,N成為限制因子,沒有足夠 N供蛋白質合成之用,藻體中硝酸還原酶及谷氨酰胺合成酶活性降低,N吸收和同化效率降低;在c(N)＞16.0 μmol/L時,隨著N濃度增加蛋白質合成受抑制,可能是 N過量誘發羥基自由基過量,抑制硝酸還原酶及谷氨酰胺合成酶活性[27]。當c(OTC)、c(WAFs)分別為 1.0～3.0 mg/L、0.1～1.0 mg/L 時,蛋白質含量隨其濃度增加而增加;當c(OTC)＞3.0 mg/L、c(WAFs)＞1.0 mg/L時,蛋白質含量隨之降低,這歸因于OTC和WAFs含量過高致使細胞提前進入衰亡期,硝酸還原酶及谷氨酰胺合成酶活性下降。

圖5 硝酸鹽、土霉素及0號柴油分散液添加對蛋白質含量的影響Fig.5 Influence of N,OTC,and WAFs addition on the content of protein

3種污染物對蛋白質合成的影響程度為N＞WAFs＞OTC,因為N濃度控制著蛋白質合成和藻的生長狀態,過量的 N和 WAFs可促進羥基自由基的產生[27],從而影響硝酸還原酶及谷氨酰胺合成酶活性而使蛋白質合成受抑制。

2.4 近海污染物對SOD活性的影響

浮游植物可通過抗氧化酶系統(如SOD、過氧化氫酶、過氧化物酶、谷胱甘肽過氧化物酶)的協同作用保護機體[26],過量活性氧類物質會破壞脂質膜、蛋白質、色素、核酸,致生產力嚴重下降,甚至使之死亡[24]。SOD活性與活性氧物質數量有關。營養鹽N的光解作用和海洋浮游植物的光化學反應均會產生·OH[29],藻細胞的生化組成會影響其光化學活性,因此,SOD活性受N、OTC和WAFs的影響,具體情況見圖6。

圖6 硝酸鹽、土霉素及0號柴油分散液添加對SOD酶活性的影響Fig.6 Influence of N,OTC,and WAFs addition on the activity of SOD

當c(N)低于32.0 μmol/L時,N濃度較低,藻生長狀況較差,藻細胞抗氧化能力較弱,故 SOD活性較低;當 c(N)為 32.0 μmol/L時,藻生長狀況最佳,抗氧化能力增強,SOD活性最高;當c(N)超過32.0 μmol/L時,N 的光解作用誘發產生大量·OH,抑制 SOD 活性。實驗結果證明海水中·OH的產生受N影響[28,30]。SOD 活性與藻類生長狀況密切相關,當 c(OTC)和c(WAFs)分別為 1.0～5.0 mg/L 和 0.1～0.5 mg/L 時,SOD 酶活性隨濃度增大而逐漸增加;當 c(OTC)和c(WAFs)分別超過3.0 mg/L和0.5 mg/L時,SOD活性隨濃度增大而降低,說明藻細胞進入衰老期,抗氧化能力減弱。

3種污染物對藻細胞抗氧化能力(即 SOD活性)的影響程度為: WAFs＞N＞OTC,與對藻生長(即藻細胞密度)的影響一致。

2.5 近海污染物對MDA含量的影響

不同濃度N、OTC和WAFs對MDA含量的影響如圖7。N、OTC和WAFs的毒性效應可能源自過量自由基的危害。N、OTC和 WAFs可促進 O2?、H2O2、·OH和1O2生成[3,12,28],致機體受到多種損害。

圖7 硝酸鹽、土霉素及0號柴油分散液添加對MDA含量的影響Fig.7 Influence of N,OTC,and WAFs addition on the content of MDA

當c(N)= 8.0 μmol/L時,葉綠素和蛋白質合成受限,活性氧過量積累,致脂質過氧化反應加強,MDA含量最大;當 c(N)= 32.0 μmol/L時,藻處最佳生長狀況,生命力最強,脂質過氧化程度低,MDA濃度最低。當 c(OTC)和c(WAFs)分別為1.0～5.0 mg/L和0.1～0.5 mg/L時,可促進藻細胞新陳代謝、葉綠素及蛋白質合成,可減少脂質過氧化,MDA含量隨之降低;當 c(N)＞32.0 μmol/L,c(OTC)和 c(WAFs)分別為10.0 mg/L和0.5 mg/L時,脂質過氧化作用增強,使得藻細胞提前進入衰亡期,MDA含量增加。

3種污染物對藻細胞脂質過氧化(即MDA含量)的影響程度為OTC?N ＞WAFs.

3 結論

當 N、OTC、WAFs濃度分別為 8.0～32.0 μmol/L,1.0～5.0 mg/L,0.1～0.5 mg/L時,威氏海鏈藻的細胞濃度、SOD活性、葉綠素a和蛋白質含量隨之增加而增加,MDA濃度隨之增大而減少;當N、OTC、WAFs濃度分別大于32.0 μmol/L,5.0 mg/ L和0.5 mg/L時,影響趨勢與上述情況相反,即藻生長及SOD活性受抑制,葉綠素和蛋白質含量降低,MDA濃度增加。

氮營養鹽、抗生素、石油烴對藻生長(即藻細胞密度)、葉綠素a合成、蛋白質生成、藻細胞抗氧化能力(即超氧化物歧化酶活性)、脂質過氧化(即丙二醛含量)的影響程度分別為 WAFs＞N＞OTC、N＞OTC＞WAFs、N＞WAFs＞OTC、WAFs＞N＞OTC、OTC?N＞WAFs。影響程度的差異,揭示近海各污染物的毒性作用機制及靶位不同。

氮營養鹽、抗生素、石油烴污染影響海洋浮游植物的生長和生化組成,而海洋浮游植物是海洋的初級生產力,故海洋的食物鏈穩定和食物鏈中能量的傳遞會受近海污染物影響。

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