不同溫度下脈沖式磷酸鹽輸入對裸甲藻生長的影響

牛海鳳,馮劍豐,周慧敏,朱 琳

(南開大學 環境科學與工程學院,環境污染過程與基準教育部重點實驗室,天津 300071)

隨著城市化進程的加快,臨海工業的迅速發展,大量的工業廢水和生活污水未經處理直接排入海中,造成近海水質不斷惡化,富營養化程度日趨嚴重,導致赤潮災害頻發,經濟損失嚴重[1-2]。作為一個復雜的海洋生態現象,引起赤潮發生的因素有很多,涉及海洋水文、氣象、物理、化學等諸多生態環境因子,但尤其以因營養鹽質量濃度增加導致的海水富營養化最為突出[3-6]。目前我國近海大部分海域已呈現出磷酸鹽限制的趨勢[7-9],而且相對于氮營養鹽的多種輸入方式[10-11],磷營養鹽多來自陸源輸入。營養鹽脈沖是指營養物質在短時間內急劇升高的現象[12],營養鹽脈沖輸入作為陸源營養鹽向海洋輸入的一種重要方式,可以調控營養物質的短期可利用性[13-18],改變海洋浮游生物的種群數量以及群落結構等[19-21]。研究結果也表明,營養鹽的不同輸入方式(連續輸入或者脈沖式輸入)能夠對浮游生物群落結構產生影響[22-24]。Yamamoto[25]在對廣島灣ohta河口的研究中,模擬脈沖輸入和連續輸入對 3種海洋赤潮微藻的影響,發現中肋骨條藻對營養鹽的脈沖輸入變化敏感,鏈狀裸甲藻在營養鹽持續添加的模式下生長較好。Sofie等[26]的研究表明,連續的營養鹽輸入模式對海洋生態系統功能產生有利影響,而高質量濃度營養鹽脈沖輸入能夠極大的影響生物的自然演替,降低生態系統的多樣性,而且極可能促進有害赤潮藻的大量爆發。劉亞林等[27]研究了脈沖式營養鹽輸入對中肋骨條藻生長的影響,結果表明營養鹽的脈沖輸入對于典型的赤潮藻中肋骨條藻生長有明顯的影響,并且營養鹽脈沖輸入的頻率和中肋骨條藻生長波動的頻率相同。

除營養鹽限制以外,溫度也是影響赤潮形成的關鍵因素[28-30]。營養鹽和溫度這兩個環境因素往往會同時影響著海洋藻類的生長,而營養鹽脈沖在不同溫度下對海洋藻類生長的影響的研究還較少。作者選取我國近岸海域的典型赤潮藻裸甲藻(Gymnodinium sp.)作為實驗藻種,在實驗室條件下,模擬陸源營養鹽的脈沖輸入方式,研究了 3種不同頻率的磷酸鹽脈沖輸入在不同溫度下(10℃和 25℃)對海洋浮游植物種群動力學的影響。

1 材料與方法

1.1 藻種及培養

實驗所用裸甲藻購自中科院海洋研究所,在溫度恒定的光照培養箱(KRG-250BP,上海柏欣儀器設備廠)內培養,培養溫度24℃±1℃,光照強度4 000 lx,光暗周期為L︰D=12︰12,培養藻種選用f/2改良培養基[31],人工海水(artificial seawater,AW)的配制參考Artificial Seawater Media[32]。

1.2 實驗方法及質量濃度設置

本實驗在 10℃和 25℃下分別采用 3種磷酸鹽(NaH2PO4)脈沖方式: 即每1天、每4天和每8天投加一次磷酸鹽,一個周期(即8天)內所加的磷酸鹽總量是相同的。每天投加一次的方式可以認為是近似連續的營養鹽輸入模式,另外兩種可以認為是不同頻率的脈沖輸入模式,這樣就可以更清晰的表明脈沖輸入相對于連續輸入模式的區別。為了更全面的反映磷酸鹽在不同質量濃度水平下的脈沖輸入對藻種生長的影響差異,本研究中磷酸鹽質量濃度分別設低、高質量濃度組。實驗開始前裸甲藻經過無磷饑餓培養,可認為實驗開始前培養基內的磷酸鹽質量濃度為零。實驗過程中,低質量濃度組初始氮質量濃度設為f/2培養基中硝酸鹽質量濃度(75 mg/L),高質量濃度組中氮質量濃度擴大4倍(300 mg/L),從而保持氮磷比遠大于16︰1,并且其他營養元素供給充足,所以本實驗中磷元素為影響裸甲藻生長的主要限制因子。不同溫度和質量濃度下均采用此 3種脈沖形式添加營養鹽,各組質量濃度設置見表1。

表1 3種脈沖輸入模式下磷酸鹽的供給量Tab.1 The amount of nutrients supply under three phosphate supply modes

1.3 實驗藻種接種及培養

實驗前,將處于指數生長期的藻液離心,將沉淀物重新懸浮于無磷培養基中饑餓培養3 d。3 d后,分別取一定體積的藻種以 3 000 r/min的速度離心5 min,棄掉上清液,用無菌人工海水洗滌后離心,重復3次,稀釋后接種至實驗培養基。初始接種密度為2×104個/mL。

實驗在體積為250 mL錐形瓶中添加100 mL培養基中進行,各實驗組設置3組平行,每天人工搖動3～4次[33],每日取樣并測定藻細胞密度,并且按照不同脈沖方式添加磷酸鹽。

1.4 藻細胞計數及磷酸鹽測定

采用血球計數板計數的方法,每天取樣在光學顯微鏡下檢測細胞密度。接種的當日為第1天,接種密度為2×104個/mL,每天在同一時間計數。取一滴裸甲藻置于血球計數板上,用魯哥試劑固定后計數,整個取樣過程都在無菌操作臺上進行。由于取樣量極少,相對于培養液總體積可以近似認為符合分批培養試驗“試驗過程中無底物和菌體的供應和移走”的要求。為了驗證實驗結果的可靠性,每2天測定一次磷酸鹽剩余量,磷酸鹽測定采用鉬銻抗分光光度法,在一個周期內,總量一定的情況下,磷酸鹽吸收量可以用加入磷酸鹽總量減去磷酸鹽剩余量來計算。

1.5 比生長率

式中,X2為某一時間間隔終結時的藻類現存量;X1為某一時間間隔開始時的藻類現存量;T2?T1為某一時間間隔。

2 結果與分析

2.1 10℃條件下,磷酸鹽脈沖對裸甲藻生長的影響

圖1a和圖2a是10℃低質量濃度磷酸鹽脈沖組下裸甲藻的生長曲線和生長率曲線,可以看出在該實驗組中裸甲藻均于第13天進入對數生長期。在對數期內,每天輸入一次的脈沖方式下藻的長勢最好。每天和每 8天輸入一次的脈沖方式下,裸甲藻分別在第8天和第10天達到第一個小峰值,分別為10.3×104個/mL和 12.7×104個/mL。在每 4天輸入一次的脈沖方式下,裸甲藻藻密度一直處于穩步上升態勢,直到實驗進行到第21天才出現了較為明顯的峰值。每天輸入一次的脈沖方式下藻的長勢最接近自然狀態下藻的的生長趨勢,生長曲線比較穩定。每4天和每 8天的脈沖方式下的裸甲藻對數期延長,在實驗周期結束時,裸甲藻依然保持較高的增長趨勢。從表2(10℃低質量濃度脈沖組磷酸鹽吸收量)中可得出,前兩個周期內,每天輸入的脈沖方式下,磷酸鹽吸收量最多,所以其長勢也最好(圖1a)。

圖1b和圖2b是10℃高質量濃度磷酸鹽脈沖組下裸甲藻的生長曲線和生長率曲線,可以看出,高質量濃度組裸甲藻的藻密度高于低質量濃度各脈沖組。每8天輸入一次的脈沖方式、每4天輸入一次的脈沖方式和每天輸入一次的脈沖方式下的裸甲藻分別在實驗進行第11天、第13天和第21天達到第一個峰值,其峰值分別為 13.8×104個/mL,9.8×104個/mL,45×104個/mL。每4天輸入一次的脈沖方式下藻的生長曲線有較大波動。每 8天輸入一次的脈沖方式下的藻密度在實驗周期內一直具有較大優勢,從表2(10℃高質量濃度脈沖組磷酸鹽吸收量)中也可得出,每8天輸入一次的脈沖方式下,磷酸鹽吸收量最多。

圖1 10℃條件下,裸甲藻在各磷酸鹽脈沖組下的生長曲線Fig.1 Growth curves of Gymnodinium sp.under three pulsed phosphate supply at 10℃

圖2 10℃條件下,裸甲藻在各磷酸鹽脈沖組下的比生長率曲線Fig.2 Growth rate curves of Gymnodinium sp.under pulsed phosphate supply groups at 10℃

表2 裸甲藻在每個周期內吸收磷酸鹽總量Tab.2 The phosphate absorption amount of Gymnodinium sp.in ones cycle

圖 3a和 3b分別表示在 10℃條件下,低、高質量濃度磷酸鹽脈沖組對裸甲藻每日藻密度平均值的影響。10℃低溫條件下,低質量濃度磷酸鹽脈沖組中(圖 3a),每天輸入一次的脈沖方式下裸甲藻的長勢在一段時間段內占據優勢,但整體來看,差異并不顯著(P＞0.05);高質量濃度磷酸鹽脈沖組中(圖 3b),每 8天輸入一次的脈沖方式下藻的長勢占據明顯優勢,差異顯著(P＜0.05)。

2.2 25℃條件下,磷酸鹽脈沖對裸甲藻生長的影響

在25℃實驗條件下,根據4a和圖5a可以看出,25℃低質量濃度組中,裸甲藻在每天輸入一次、每4天輸入一次和每 8天輸入一次的脈沖方式下,先后達到第一個小峰值,分別為15×104個/mL(第9天)、11.17×104個/mL(第 10 天)和 17.83×104個/mL(第 12天)。在整個試驗周期中,每天輸入一次的脈沖方式下的裸甲藻密度具有較大優勢,每4天和每8天輸入一次的脈沖方式下的生長曲線波動性較大。隨著實驗的進行,每天輸入的脈沖方式下的裸甲藻進入衰亡期,藻密度不斷下降,而每4天和每8天脈沖輸入方式下的藻密度不斷波動上漲,藻的生長周期延長。從表2(25℃低質量濃度脈沖組磷酸鹽吸收量)中得出的實驗結果也支持上述觀點。

圖4b和圖5b是25℃高質量濃度磷酸鹽脈沖組下裸甲藻的生長曲線和生長率曲線,由圖中可得出,裸甲藻在各脈沖輸入方式下達到第一個小峰值的的時間和密度大小分別為: 每 8天輸入一次(21.83×104個/mL,第9天),每4天輸入一次(18.5×104個/mL,第10天),每天輸入一次(33.5×104個/mL,第11天)。在整個試驗周期中。每天輸入的脈沖方式下裸甲藻的藻密度具有明顯的優勢。從表 2(25℃高質量濃度脈沖組磷酸鹽吸收量)中得出,每天輸入一次的脈沖方式下,藻的磷酸鹽吸收量最大,與藻密度曲線所得出的結論相符。

圖3 10℃條件下磷酸鹽脈沖組對裸甲藻每日藻密度平均值的影響Fig.3 The effect of pulsed phosphate supply on the daily average of Gymnodinium sp.density at 10℃

圖4 25℃條件下,裸甲藻在各磷酸鹽脈沖組下的生長曲線Fig.4 Growth curves of Gymnodinium sp.under three pulsed phosphate supply at 25℃

圖 6a和圖 6b分別表示在 25℃條件下,低、高質量濃度磷酸鹽脈沖組對裸甲藻每日藻密度平均值的影響。與 10℃低溫條件下的結果不同,在 25℃常溫條件下(圖 6),無論是低質量濃度脈沖組還是高質量濃度脈沖組,基本表現為每天輸入一次的脈沖方式下的裸甲藻藻密度都占有較明顯優勢(低質量濃度組 P＜0.01;高質量濃度組 P＜0.01)。在 25℃常溫條件下,脈沖頻率對裸甲藻的的影響基本表現為: 隨著脈沖間隔的增加,裸甲藻的平均藻密度呈先降低后升高的趨勢,在中等頻率的脈沖下,藻密度最低。

圖5 25℃條件下,裸甲藻在各磷酸鹽脈沖組下的比生長率曲線Fig.5 Growth rate curves of Gymnodinium sp.under pulsed phosphate supply groups at 25℃

圖6 25℃條件下磷酸鹽脈沖組對裸甲藻每日藻密度平均值的影響Fig.6 The effect of pulsed phosphate supply on the daily average of Gymnodinium sp.density at 25℃

3 討論與結論

在 10℃實驗組中,磷酸鹽輸入頻率的變化會對裸甲藻的生長狀況產生影響,并且因磷酸鹽質量濃度的不同而不同。低質量濃度磷酸鹽脈沖條件下: 每天輸入一次的脈沖方式下的裸甲藻先達到一個小峰值,但其峰值小于另外兩種脈沖方式;進入對數期后,每天輸入的脈沖方式下的裸甲藻在一段時間內具有較大優勢,并且該方式下裸甲藻的長勢接近自然狀態下藻的生長周期,有比較明顯的調整期、對數期、穩定期和衰亡期;隨著實驗時間延長,每4天和每 8天脈沖輸入模式下的藻細胞數量才逐漸超過每天輸入一次的脈沖方式。有關研究也表明,低溫脅迫下,初始階段藻的適應能力較差,光合作用弱,隨著實驗時間延長,才逐漸啟動恢復機制[34]。每4天和每8天的脈沖輸入方式下的裸甲藻對數期延長,在實驗周期結束時,裸甲藻依然保持較高的增長趨勢,生長周期延長,相關的研究成果也表明脈沖間隔的增加在一定條件下會延長藻的生長周期[35]。在10℃實驗組的高質量濃度磷酸鹽脈沖條件下: 每 8天輸入一次的脈沖方式下藻的長勢在整個試驗周期中具有明顯優勢,并且在試驗周期內一直保持上升態勢,這與低質量濃度組所得的結果有所差異。這可能是因為在低溫脅迫以及高質量濃度磷酸鹽水平下,藻的其他生理指標發生變化,而沒有在藻密度方面體現出來,這一點有待于作者做進一步的研究。該脈沖組中,每天輸入一次的脈沖方式下藻的生長曲線較為平穩。

通過比較發現,在 10℃實驗條件下,無論是低質量濃度脈沖組還是高質量濃度脈沖組,每天輸入的脈沖方式下的裸甲藻生長曲線都較為穩定,這可能是因為脈沖輸入模式相比連續輸入模式對藻類生長的干擾程度強,而每天輸入的方式接近連續輸入模式,使得另外兩種脈沖輸入方式對裸甲藻生長的干擾更大,劉亞林等[27]的研究也表明,每天輸入的脈沖模式下,藻的生長曲線最為平穩。

在 25℃實驗組中,無論是低質量濃度脈沖組還是高質量濃度脈沖組,每天輸入一次的脈沖方式下的裸甲藻藻密度都具有比較大的優勢,這可能是因為每天輸入模式給藻的生長創造了一個較為穩定的環境,使其較快適應環境,有利于藻的生長。每4天和每 8天輸入的脈沖方式下的藻類生長曲線波動較大,每天輸入的脈沖方式下的生長曲線相對平穩,這也與 10℃實驗組所得的結論一致。根據磷酸鹽脈沖組對裸甲藻每日藻密度平均值的影響結果可得出,較高溫度條件下,長周期脈沖輸入方式可能會導致裸甲藻的平均密度下降,而在較低溫度及較高的磷酸鹽質量濃度水平下,長周期脈沖輸入方式可能會導致藻細胞數量的顯著增加,從而可能引發甲藻赤潮的形成。

在所有實驗組中,脈沖頻率對裸甲藻的的影響基本表現為: 隨著脈沖間隔的增加,裸甲藻的平均藻密度呈先降低后升高的趨勢,在中等頻率的脈沖下,藻密度最低,出現這種結果可能有以下兩方面的原因: 一方面是因為設定的脈沖頻率較少,還不能夠完全反應出藻種在不同脈沖頻率下的生長狀況;另一方面,可能是因為藻的其他生理指標發生了變化,但是沒有在藻密度方面體現出來。這一點也需要作者做更深入的研究,以進一步探索脈沖式營養鹽輸入對海洋浮游植物的影響。

本文的研究結果表明,近似連續的輸入方式(每天輸入一次的脈沖方式)下藻的生長狀況比脈沖式的輸入方式(每4天和每8天輸入一次的脈沖方式)穩定,后兩者生長曲線波動較為明顯,這說明脈沖輸入模式對藻類生長的干擾程度強于連續輸入模式;在較高溫度條件下,長周期脈沖輸入方式可能會導致赤潮藻的平均密度下降,而在低溫及較高的磷酸鹽質量濃度水平下,長周期脈沖輸入方式可能會導致藻細胞數量的顯著增加,從而可能引發甲藻赤潮的形成。

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