新型鐵系金屬(M=Ni，Co)配合物的合成及其與DNA的相互作用*

段冉冉，王璐，霍煒強，陳實，1b，周曉華，1b

(1.華南農(nóng)業(yè)大學a.理學院應用化學系;b.生物材料研究所，廣東 廣州 510642)

新型鐵系金屬(M=Ni，Co)配合物的合成及其與DNA的相互作用*

段冉冉1a，王璐1a，霍煒強1a，陳實1a，1b，周曉華1a，1b

(1.華南農(nóng)業(yè)大學a.理學院應用化學系;b.生物材料研究所，廣東 廣州 510642)

以1，10-鄰菲羅啉(Phen)和2，4-二氨基-6-(2-吡嗪)-均三嗪(DAPT)為配體，與鐵系金屬(M=Ni，Co)鹽反應合成了兩個新型的金屬配合物——［Ni(Phen)(DAPT)Cl2］·3H2O(3a)和［Co(Phen)(DAPT)Cl2］·3H2O (3b)，其結構和性能經(jīng)IR，LC-MS，元素分析，TG-DTA和摩爾電導率表征。用UV-Vis、溴化乙錠熒光競爭光譜、相對粘度、電化學、DNA熱變性及鹽效應等方法研究了3a和3b與小牛胸腺DNA(ct-DNA)的相互作用。實驗結果表明:3a和3b與ct-DNA的結合模式均為插入模式;3a與ct-DNA的結合強度略大于3b。

金屬(II)配合物;鄰菲羅啉;均三嗪;合成;DNA;作用模式

鄰菲羅啉(Phen，1)及其衍生物具有剛性平面結構，可快速插入到DNA或RNA中與其結合［1-2］，對某些腫瘤有較強的抑制作用，其金屬配合物的抗癌活性更高［3-4］，Phen-Cu(II)配合物還具有化學核酸酶活性以及對DNA分子序列的選擇性。1979年，Sigman等［5］就報道了Cu能切割DNA。傾向于在小溝5'-TAT序列上切割脫氧核苷的糖環(huán)，使DNA的螺旋結構發(fā)生扭曲，這種切割作用有利于Phen的滲透并與DNA鏈產(chǎn)生插入或溝槽結合作用［6-7］。

2，4-二氨基-6-(2-吡嗪基)均三嗪(DAPT，2)是具有較大共軛體系的氮雜芳環(huán)化合物，其多氮結構具有很強的氫鍵識別性，常常用作DNA印記識別分子。1988年，Asanuma等［8］報道了具有類似三嗪結構的PVDAT可以在水中識別核酸的堿基及衍生物，并與不同堿基形成不同的氫鍵作用; Slinchenko等［9-10］證明了4，6-二氨基-1，3，5-三嗪(DAT)及其衍生物對DNA雙鏈的A-T堿基具有識別作用的主要原因在于DAT結構可以通過氫鍵與DNA中富含大量氫鍵受體和供體的堿基產(chǎn)生作用。

綜上可見，1及其衍生物與過渡金屬形成的配合物可以用作核酸切割酶，進而有一定的抗癌活性;2及其過渡金屬配合物對DNA堿基序列具有識別作用。因此，在DNA的識別和修復中，結構類似于［M(Phen)L］2+的配合物能夠插入并堆積到DNA雙螺旋堿基對中間［11-12］。合成以1和2為配體的三元金屬配合物并研究其與DNA的相互作用，對篩選DNA靶向抗癌藥物具有一定的意義。

為此，本文以1和2為配體，與鐵系金屬(M= Ni，Co)鹽反應合成了兩個新型的金屬配合物——［Ni(Phen)(DAPT)Cl2］·3H2O(3a)和［Co(Phen) (DAPT)Cl2］·3H2O(3b)(Chart 1)，其結構和性能經(jīng)IR，LC-MS，元素分析，TG-DTA和摩爾電導率表征。用UV-Vis［13］、溴化乙錠熒光競爭光譜、相對粘度、電化學、DNA熱變性及鹽效應等方法研究了3a和3b與小牛胸腺DNA(ct-DNA)的相互作用。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Shimadzu UV-2550型紫外/可見分光光度計; Nnicolet ACATAR 360型紅外光譜儀(KBr壓片); Agilent6430型質(zhì)譜儀(甲醇為溶劑);ELEMENTAR Vario EL型元素分析儀;DDS-12A型電導率儀(掃描速度50 mV·S-1，掃描電位1.0 V～-1.0 V);HITACHIF-4500型熒光光譜儀(λex= 510 nm，掃描速度240 nm·s-1);CHI-6600型電化學工作站。

2按文獻［14］方法合成;ct-DNA，Sigma試劑公司;其余所用試劑均為分析純，上海國藥試劑公司;實驗用水為重蒸餾水。

1.2 3a和3b的合成

在反應瓶中依次加入NiCl2·6H2O 237.7 mg (1 mmol)，1 198.2 mg(1 mmol)，2 188.0 mg(1 mmol)和適量乙醇，攪拌使其溶解;用20%NaOH溶液調(diào)至pH 6.2，攪拌下于70℃(回流)反應2 h。冷卻至室溫，靜置析晶，過濾，濾液緩慢揮發(fā)后析出綠色晶體，過濾，濾餅干燥得綠色固體3a 410.3 mg，收率72%;UV-Vis(CH3OH，下同) λmax:269 nm;IRν:3 258，3 136，1 616，1 518，1 045，810，727 cm-1;TG(weight loss%):Calcd for［Ni(Phen)(DAPT)Cl2］·3H2O:H2O 9.87，Cl 12.68，Phen 32.65，DAPT 34.36;found H2O 9.78，Cl 12.86，phen 32.09，DAPT 34.24;ESMS m/z:Calcd for C19H19N9O2Cl2Ni{［M++Cl］-} 464.1，found 464.14;Anal.calcd for C19H19N9O2Cl2Ni:C 41.27，H 3.76，N 23.25;found C 41.25，H 3.83，N 23.78。

用CoCl2·6H2O替代NiCl2·6H2O(乙腈為溶劑，pH 5.8)，用類似的方法合成暗紅色固體3b 392.4 mg，收率69%;UV-Visλmax:269 nm;IR ν:3 114，3 298，1 628，1 514，1 062，825，717 cm-1;TG(weight loss)(%):Calcd for［Co(Phen) (DAPT)Cl2］·3H2O:H2O 9.69，Cl 12.77，Phen 32.58，DAPT 33.96;found H2O 9.78，Cl 12.87，Phen 32.09，DAPT 34.24;ES-MS m/z:Calcd for C19H19N9O2Cl2Co{［M++Cl］-}464.4，found 464.3; Anal.calcd for C19H19N9O2Cl2Co:C 40.82，H 3.71，N 23.41;found C 41.26，H 3.83，N 23.79。

1.3 性能測定

(1)電子吸收光譜

以Tris-HCl/NaCl緩沖溶液為空白液，測定配合物在200 nm～400 nm處的電子吸收光譜。分別在空白池和樣品池中加入等體積的ct-DNA溶液，于室溫反應2 h，測定其在200 nm～400 nm處的電子吸收光譜。同理測定不同濃度比的配合物/ct-DNA溶液的電子吸收光譜。

(2)熒光光譜

將溴化乙啶(EB，3μmol·L-1)與ct-DNA (1.2μmol·L-1)加入3 mL Tris-HCl/NaCl緩沖溶液中，靜置4 h。測定EB/ct-DNA溶液在510 nm～710 nm處的熒光強度。僅改變配合物的量，于室溫反應15 min，測定不同濃度配合物/ct-DNA/EB溶液在510 nm～710 nm處的熒光強度。

(3)粘度實驗

將ct-DNA溶液(0.12 mmol·L-1)與不同濃度的配合物混勻，靜置1 h，用烏氏粘度計于29.0℃±0.1℃測定其粘度，按下式計算相對粘度:

式中:t為ct-DNA溶液(含有不同濃度的配合物)流經(jīng)毛細管所需的時間;t0為緩沖溶液流經(jīng)毛細管所需的時間

ct-DNA溶液相對粘度隨配合物加入量的變化以(η/η0)1/3對c(3)/c(ct-DNA)作圖表示(η0為未加配合物時ct-DNA溶液的相對粘度)

(4)熱變性實驗

在UV-Vis分光光度計的樣品池中加入3.0 mL ct-DNA溶液(70μmol·L-1)或含配合物(10 μmol·L-1)的ct-DNA溶液(70μmol·L-1)，以磷酸鹽緩沖液為參比，升溫速率1℃·min-1)，于42℃～92℃內(nèi)，每升高2℃，記錄ct-DNA溶液在260 nm處的吸光度A260。ct-DNA的熔點(Tm)，通過A260對溫度T作圖。

(5)電化學實驗

在含配合物(80μmol·L-1)的緩沖溶液中，逐漸增加ct-DNA濃度，測試循環(huán)伏安曲線。

(6)鹽效應實驗

在含配合物(10μmol·L-1)的ct-DNA溶液(10μmol·L-1)中依次加入不同濃度的NaCl溶液，待反應達到平衡，測定配合物/ct-DNA/NaCl溶液的熒光強度。

2 結果與討論

2.1 表征

(1)UV-Vis

在UV-Vis光譜(圖略)中，1和2的甲醇溶液分別在265 nm和275 nm處有吸收峰，3a和3b的甲醇溶液在269 nm處出現(xiàn)較強吸收峰，這些吸收峰歸屬芳環(huán)的π→π*躍遷。與1和2相比，3a和3b的最大吸收峰位置發(fā)生了偏移，強度增強，這是兩個配體吸收峰疊加的結果。

(2)IR

IR分析表明，3a和3b在3 300 cm-1附近均有特征吸收峰，這是結晶水的-OH振動峰;3 110 cm-1～3 140 cm-1處的中強度吸收峰歸屬2; 1 620 cm-1，720 cm-1和820 cm-1處的中強吸收峰是1的芳環(huán)振動峰和C-H振動峰;1 510 cm-1附近的吸收峰是2的C=N伸縮振動峰，說明1和2均參與配位。

(3)ES-MS

ES-MS分析表明，3a和3b分別出現(xiàn)正離子峰464.1和464.3，說明兩個配合物中分別有離子碎片［Ni(Phen)(DAPT)Cl］+和［Co(Phen) (DAPT)Cl］+。

(4)元素分析

元素分析的理論值和測試值基本吻合，由此可以推斷配合物的組成與實際相符合。

(5)TG-DTA

TG測試結果表明:在100℃以內(nèi)出現(xiàn)失結晶水放熱峰，失重率與推測結果吻合，說明兩個配合物分子中3個H2O位于外界，沒有參與配位。TG-DTA曲線一共出現(xiàn)四次質(zhì)量變化的平臺，分別對應H2O(50℃～100℃)，Cl(100℃～200℃)，1(350℃～465℃)和2(450℃～600℃)的失去，其失重率都與配合物的組成式基本吻合。

(6)摩爾電導率

在甲醇溶液中，3a和3b的摩爾電導率分別為12.4 S·m2·mol-1和13.6 S·m2·mol-1，說明他們均為非電解質(zhì)［15］。

綜合以上分析結果，推測配合物的分子式分別為［Ni(Phen)(DAPT)Cl2］·3H2O(3a)和［Co (Phen)(DAPT)Cl2］·3H2O(3b)，可能的分子結構如Chart1所示。

2.2 配合物與ct-DNA的相互作用

(1)電子吸收光譜

3a，3b和EB分別與ct-DNA相互作用的電子吸收光譜見圖1。由圖1可見，EB/ct-DNA溶液的UV-Vis譜圖出現(xiàn)了明顯的減色效應與紅移現(xiàn)象。3a/ct-DNA和3b/ct-DNA溶液也都出現(xiàn)了明顯的減色效應和輕微的紅移(分別為3 nm和4 nm)，說明3a和3b與EB類似，通過插入方式與ct-DNA結合。通過文獻［16］方法計算3a，3b和EB與ct-DNA嵌插作用的結合常數(shù)分別為1.7× 105，1.0×105和8.0×105，說明與ct-DNA嵌插作用的強弱順序為:EB＞3a＞3b，且3a和3b與ct-DNA的結合強度接近。

圖1 3a，3b和EB在不同濃度ct-DNA溶液中的電子吸收光譜*Figure 1 Absorption spectra of 3a，3b and EB with ct-DNA*c(3a)=20μmol·L-1，c(3b)=10μmol·L-1，c1(DNA)= (0，1，2，3，5，7，10，15)μmol·L-1，c(EB)=2μmol·L-1，c2(DNA)=(0，0.05，0.2，0.4，0.6，0.8，1)μmol·L-1

(2)熒光光譜

3a，3b分別和EB競爭的熒光光譜見圖2。由圖2可見，隨著配合物的濃度的增加，其溶液的熒光強度大幅度降低。這是可能是由于3a和3b插入ct-DNA堿基對使ct-DNA雙鏈有一定的扭曲變形，EB從堿基對間逸出使體系熒光發(fā)生淬滅。通過Stem-Volmer方程［17］方法計算出3a和3b的熒光猝滅常數(shù)分別為2.2×105和1.1×105。說明3a和3b對ct-DNA有一定的插入作用，且3a與ct-DNA的作用力略強于3b。

圖2 3a或3b對EB/ct-DNA溶液熒光光譜的影響*Figure 2 Effects of 3a or 3b to EB/ct-DNA on emission spectra*c(DNA)=12μmol·L-1; c(3a)/c(DNA)=0，0.1，0.2，0.3，0.5，0.6，0.9，1.2; c(3b)/c(DNA)=0，0.1，0.2，0.3，0.5，0.7，0.8

(3)粘度實驗

配合物以靜電、溝面結合等方式與DNA作用時，DNA溶液的粘度基本不發(fā)生明顯變化。配合物以插入方式與DNA作用時，DNA的雙螺旋會伸長，溶液的相對粘度增大。以插入劑EB和溝槽劑Hoechst 33258為參照，ct-DNA溶液相對粘度隨著配合物加入的變化見圖3。由圖3可見，隨著EB，3a和3b的加入，ct-DNA溶液的相對粘度逐漸增加。而隨著Hoechst 33258的逐漸加入［18］，ct-DNA溶液的相對粘度無明顯變化，由此可判斷3a和3b與ct-DNA的結合模式不同于溝槽劑Hoechst 33258，應是插入模式。根據(jù)ct-DNA溶液相對粘度的變化幅度推測出他們與ct-DNA作用的強弱順序為:EB＞3a＞3b＞Hoechst33258。

圖3 3a，3b對ct-DNA溶液相對粘度的影響Figure 3 Effects of3a or 3b to viscosity of ct-DNA

(4)熱變性實驗

化合物與DNA以插入方式結合時，由于插入試劑與DNA間的π-π堆砌作用，使DNA的Tm增高［19-20］;化合物與DNA以非插入方式結合時，Tm不變或變化不顯著。3a和3b與ct-DNA作用的熱變性曲線見圖4。由圖4可見，加入3a和3b后，ct-DNA的Tm由67℃分別增到74℃和76℃，表明3a和3b都是以插入方式和ct-DNA結合，且插入的強弱順序為:3a＞3b。

圖4 3a或3b與ct-DNA作用的熱變性曲線Figure 4 Effect of 3a or 3b to thermostability of ct-DNA

(5)電化學實驗

配合物與DNA作用后氧化還原峰電位負移，則發(fā)生靜電作用;配合物與DNA作用后其電位正移，則發(fā)生插入作用［21-22］。圖5是配合物/ct-DNA的循環(huán)伏安曲線。由圖5可見，加入ct-DNA后，峰電流降低，同時電流的峰位有明顯的正移，說明配合物與ct-DNA發(fā)生了插入作用。根據(jù)峰電流降低的幅度，推測3a與ct-DNA的結合強度大于3b。

(6)鹽效應實驗

離子強度對配合物/DNA復合體系的熒光光譜的影響可以判斷配合物與DNA之間是否有靜電作用［23-24］，不同濃度NaCl對配合物與ct-DNA復合體系的熒光強度影響見圖6。

圖5 3a或3b對ct-DNA溶液循環(huán)伏安曲線的影響Figure 5 Effects of 3a or 3b to ct-DNA on cyclic voltammetry curves

圖6 NaCl對3a或3b/ct-DNA溶液熒光強度的影響Figure 6 Effects of NaCl to 3a(or 3b)/ct-DNA on FL intensities

由圖6可見，隨著c(NaCl)的增大，3a和3b的熒光強度都沒有發(fā)生明顯變化，由此可以推斷3a和3b與ct-DNA均無靜電作用。

3 結論

配體1和2與鐵系金屬(M=Ni，Co)鹽反應合成了兩個新型的金屬配合物［M(Phen) (DAPT)Cl2］·3H2O(3a，3b)。用UV光譜法、溴化乙錠熒光競爭光譜法、相對粘度法、電化學法、DNA熱變性法及鹽效應法研究了3a和3b與ct-DNA的作用模式。實驗結果表明:3a和3b中的配體皆以插入方式與DNA結合，且3a與ct-DNA的插入作用略強于3b，這可能是由于Ni(II)比Co(II)多1個3d電子，配合物中存在d-p反饋π鍵，3a的π電子云密度略高于3b的緣故。

以上結論對抗癌藥物篩選和DNA分子識別有一定幫助。配合物對DNA的結合位點、序列選擇性及其抗菌抗癌活性有待進一步研究。

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Synthesis of Two Novel Metal(M=Ni，Co)Complexes and Their Interaction with DNA

DUAN Ran-ran1a，WANG Lu1a，HUOWei-qiang1a，CHEN Shi1a，1b，ZHOU Xiao-hua1a，1b
(a.Department of Applied Chemistry，College of Science;b.Institute of Biomaterial，1.South China Agricultural University，Guangzhou 510642，China)

Two novelmetal(M=Ni，Co)complexes，［Ni(Phen)(DAPT)Cl2］·3H2O(3a)and［Co (Phen)(DAPT)Cl2］·3H2O(3b)，were synthesized by coordination of 1，10-phenanthroline(Phen) with 2，4-diamido-6-(2-pyrazine)-1，3，5-triazine(DAPT)and Nickel(Ⅱ)or Cobalt(Ⅱ).The structures and propertieswere characterized by IR，LC-MS，elemental analysis，TG-DTA and molar conductivity.The interaction of 3a，3b with calf thymus DNA(ct-DNA)were investigated by UVVis，EB competition FL，relative viscosity，cyclic voltammetry，DNA thermal denaturation and salt effectsmethod.The results showed that the interaction models of3a and 3b with ct-DNA were intercalativemodel;3a exhibited stronger affinity force compared with 3b.

metal complex;1，10-phenanthroline;triazine;synthesis;DNA;interaction model

O614.81;O621.3

A

1005-1511(2014)02-0168-06

2013-10-09;

2014-01-20

廣東省科技計劃資助項目(2010B020311010);華南農(nóng)業(yè)大學“211工程”三期重點建設項目

段冉冉(1987-)，女，漢族，山東棗莊人，碩士研究生，主要從事生物無機化學的研究。

周曉華，副教授，E-mail:zhouxiaohua1970@163.com