青蒿素衍生物抗癌機(jī)制探討

曹智剛?袁守軍?陳惠鵬?徐蘭平?田增月

【摘要】 目的 探討青蒿素衍生物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生自由基， 引導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡的機(jī)制。方法 測定小鼠腫瘤動物模型的瘤體鐵含量、觀察青蒿素衍生物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生自由基、采用單細(xì)胞彗星電泳法觀察自由基對腫瘤細(xì)胞DNA殺傷的效應(yīng)。結(jié)果 小鼠的H22瘤體的鐵含量顯著高于血和肌肉、肺組織鐵含量， Lewis肺癌的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相同。K562細(xì)胞經(jīng)青蒿素衍生物作用， 能測出微量的自由基。青蒿素衍生物作用K562細(xì)胞可引起DNA損傷并溢出細(xì)胞。結(jié)論 青蒿素衍生物可在含鐵量較高的腫瘤細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生自由基， 導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡。

【關(guān)鍵詞】 青蒿素衍生物；腫瘤；鐵

Approach free radical of artemisinine derivatives for anticancer mechanism CAO Zhi-gang， YUAN Shou-jun， CHEN Hui-peng， et al. Dalian Sanatorium Taoyuan Branch， Dalian 116013， China

【Abstract】 Objective To explore mechanism of artemisinine derivatives induced tumor of cytogenic free radical and loading to tumors cell death. Methods Iron-content for tumor body of mouse tumor of animal model was evaluated and the antipersonnel effect of tumor of cytogenic free radical for DNA with artemisinine derivatives by Mono-cell comet caraphoresis induced was studied. Results The iron-content of blood， muscle and lung is toper of tumor-body. artemisinine derivatives induced K562 tumor cell of cytogenic free radical and caused DNA damnification and flowed outward of cell envelope. Conclusion Artemisinine derivatives can induce tumor of cytogenic free radical to kill tumor.

【Key words】 Artemisinine derivatives； Toumer； Iron

自90年代以來發(fā)現(xiàn)青蒿素類藥物有一定的抗癌作用。青蒿素類藥物因化學(xué)結(jié)構(gòu)與目前臨床上常用的化療藥有所不同， 治療瘧疾的臨床應(yīng)用顯示藥物毒副作用小， 展現(xiàn)了抗癌的發(fā)展前景， 但青蒿素抗癌的機(jī)理尚不清楚。本文就青蒿素衍生物的自由基抗癌機(jī)制進(jìn)行探討， 研究青蒿素衍生物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生自由基， 引導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡的機(jī)理。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1. 1 實(shí)驗(yàn)材料 細(xì)胞株采用K562， 小鼠是昆明種及C57小鼠， 18～22 g，雌雄兼用， 鐵測定采用血清鐵試劑盒， RnaseA， 熒光染料羅丹明123。使用CHK型光學(xué)顯微鏡， 凝膠成像掃描儀等觀察。

1. 2 實(shí)驗(yàn)方法

1. 2. 1 小鼠腫瘤動物模型的瘤體鐵含量測定方法 將昆明小鼠接種Lewis肺癌株和H22肝癌株， 接種時間為7 d， 后將實(shí)驗(yàn)鼠斷頸處死， 取出腫瘤稱重。制備腫瘤勻漿采用每克瘤重加1 ml生理鹽水并混勻。取1 ml腫瘤勻漿離心， 吸取上清液。經(jīng)1：4比例稀釋后。以3000 r/min速度高速離心， 各瘤體組織取樣250 μl上清液用吸光度波長540 nm測定鐵勻漿濃度， 并比對標(biāo)準(zhǔn)血清鐵。測定OD值， 數(shù)據(jù)作統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

1. 2. 2 青蒿素衍生物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生自由基的測定 將K562細(xì)胞計(jì)數(shù)后收集在100 ml 培養(yǎng)瓶中， 每瓶收集約1000萬個細(xì)胞。1640（+）培養(yǎng)液培養(yǎng)后， 將實(shí)驗(yàn)組K562細(xì)胞培養(yǎng)液中加入青蒿素衍生物藥物達(dá)終濃度4 μg/ml。原液35 μg/ul，配成1 ug/μl， 每培養(yǎng)瓶加藥20 μl處理30 min。放入5%CO2， 37℃溫箱中孵育。對照組的處理?xiàng)l件相同。離心， 孵育后收集細(xì)胞上清液加自由基捕捉劑， 用ESP300電順磁共振波譜儀檢測自由基。

1. 2. 3 腫瘤細(xì)胞彗星電泳實(shí)驗(yàn) A549細(xì)胞經(jīng)CO2孵箱中培養(yǎng)生長近飽和時， 加入青蒿素衍生物（終濃度為50 μg/ml）， 作用24 h。用PBS沖洗， 吸取90 μl 1%瓊脂糖（約70℃）均勻涂于載坡片上， 取50 μl細(xì)胞液和1% LMA用1：3比例在37℃條件下混勻并快速吸取90 μl， 均勻涂布在低層膠上， 浸入溶解液中， 再浸入解旋液中， 浸入電泳槽中， 用65 V電泳10～20 min玻片上染色10 min， 反射式熒光顯微鏡下觀察溢出情況并照相。

2 結(jié)果

2. 1 小鼠腫瘤動物模型的瘤體鐵含量測定 測定H22肝癌模型和Lewis肝癌模型的小鼠瘤體的鐵含量， 瘤體來源分別為血、肌肉、肺組織。瘤體的鐵含量高于血和肌肉、肺組織的鐵含量。

2. 2 經(jīng)青蒿素衍生物處理腫瘤細(xì)胞， 測定自由基 經(jīng)青蒿素衍生物處理K562細(xì)胞， 可產(chǎn)生微量的自由基。

2. 3 單細(xì)胞彗星電泳評定DNA損傷的實(shí)驗(yàn)結(jié)果 青蒿素衍生物處理K562細(xì)胞導(dǎo)致DNA損傷并溢出細(xì)胞膜， 能觀察到細(xì)胞拖尾現(xiàn)象， 青蒿素產(chǎn)生的自由基可引起 DNA的損傷。endprint

3 討論

青蒿素類藥物抗腫瘤機(jī)制類同抗瘧藥的作用機(jī)制。青蒿素的抗瘧通過鐵離子， 能促進(jìn)青蒿素的過氧基團(tuán)分解， 產(chǎn)生自由基， 攻擊瘧原蟲。因腫瘤細(xì)胞的核酸代謝需要更多的鐵， 實(shí)驗(yàn)觀察癌細(xì)胞內(nèi)的鐵含量遠(yuǎn)高于正常細(xì)胞， 許多腫瘤細(xì)胞表面轉(zhuǎn)鐵蛋白受體明顯高于正常細(xì)胞轉(zhuǎn)鐵蛋白受體；腫瘤中的鐵可能引導(dǎo)青蒿素產(chǎn)生更多的過氧化基團(tuán)， 提示青蒿素類藥物可能選擇性殺傷腫瘤細(xì)胞。

Singh等[1]觀察并報(bào)道將轉(zhuǎn)鐵蛋白和雙氫青蒿素同時使用可選擇性殺傷molt-4淋巴白血病細(xì)胞和淋巴細(xì)胞， 對人乳癌細(xì)胞也具有較強(qiáng)的選擇性毒性作用。使用硫酸亞鐵并合用雙氫青蒿素， 可減慢大鼠的移植纖維肉瘤生長[2]。

作者前期研究[3]觀察到雙氫青蒿素較強(qiáng)的抑制小鼠腫瘤模型中腫瘤的生長， 測定小鼠的腫瘤瘤體的鐵含量明顯高于血和肌肉、肺組織的鐵含量， 顯示了青蒿素類藥物對腫瘤細(xì)胞可能存在特異性殺傷效應(yīng)， 即青蒿素對機(jī)體殺傷作用小， 對體內(nèi)腫瘤殺傷作用強(qiáng)， 由此青蒿素類藥物治療腫瘤， 藥物的副作用可能較小。實(shí)驗(yàn)也證實(shí)腫瘤細(xì)胞鐵代謝旺盛， 瘤體鐵含量較高。

實(shí)驗(yàn)也表明， 通過青蒿素衍生物處理K562細(xì)胞， 可產(chǎn)生微量的自由基。青蒿素衍生物作用K562細(xì)胞后引起DNA損傷并溢出細(xì)胞膜形成拖尾現(xiàn)象， 提示增加腫瘤細(xì)胞內(nèi)的鐵含量， 有可能增加青蒿素衍生物處理腫瘤細(xì)胞后， 腫瘤細(xì)胞內(nèi)自由基量的增加， 提高青蒿素衍生物的抗癌效應(yīng)。

合用鐵與青蒿素衍生物， 明顯增強(qiáng)青蒿素衍生物殺傷腫瘤細(xì)胞的能力， 使用青蒿素衍生物治療腫瘤， 可以為腫瘤的治療提供一種新的治療思路。也可以提示某種青蒿素衍生物與鐵合成有可能成為復(fù)方抗癌藥物。

參考文獻(xiàn)

[1] Singh NP， Lai H. Selsective toxicity of dihydroartemiasnin and holotransferrin toward human breast cancer cells. Life Science， 2001，70（1）：49-56.

[2] Moore JC， Lai H， Li JR， et al. Oral administration of dihydroarte-miasnin and ferrous sulfate retarded implanted fibrosarcoma growth in the rat. Cancer Lett， 1995，98（1）：83.

[3] 曹智剛，袁守軍.雙氫青蒿素對腫瘤細(xì)胞及腫瘤動物模型的抑制作用.實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志， 2006（24）：2835-2837.endprint