黃芪甲苷、人參皂苷Rg1、Rb1和三七皂苷R1抗小鼠腦缺血再灌注氧化應(yīng)激損傷和促進能量代謝的配伍研究

黃小平，王 蓓，邱詠園，曾 嶸，鄧常清，唐映紅*

（湖南中醫(yī)藥大學分子病理實驗室，湖南省中西醫(yī)結(jié)合心腦血管疾病重點實驗室，細胞生物學與分子技術(shù)湖南省高校重點實驗室，湖南 長沙 410208）

黃芪甲苷、人參皂苷Rg1、Rb1和三七皂苷R1抗小鼠腦缺血再灌注氧化應(yīng)激損傷和促進能量代謝的配伍研究

黃小平，王 蓓，邱詠園，曾 嶸，鄧常清，唐映紅*

（湖南中醫(yī)藥大學分子病理實驗室，湖南省中西醫(yī)結(jié)合心腦血管疾病重點實驗室，細胞生物學與分子技術(shù)湖南省高校重點實驗室，湖南 長沙 410208）

目的 從氧化應(yīng)激和能量代謝研究黃芪甲苷、人參皂苷Rg1、Rb1和三七皂苷R1抗小鼠腦缺血再灌注損傷的配伍關(guān)系，明確其有效的配伍劑量。方法 采用L9（34）正交試驗法，將C57BL/6小鼠隨機分組，連續(xù)給藥3 d后結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈造成腦缺血20 min，再灌注30 min，測定腦組織三磷酸腺苷（ATP）、還原型谷胱甘肽（Glutathione，GSH）含量、丙二醛（Malonaldehyde，MDA）的含量及超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）的活性。結(jié)果 黃芪甲苷、人參皂苷Rb1、Rg1和三七皂苷R1能增加腦組織中ATP、GSH含量和SOD活性，降低MDA的含量，對腦缺血再灌注后的氧化應(yīng)激損傷具有抑制作用，改善腦組織能量代謝。4種有效成分配伍具有增強抗腦缺血再灌注損傷的作用。結(jié)論 4種有效成分抗小鼠腦缺血再灌注后氧化應(yīng)激損傷和改善能量代謝的有效配伍劑量為黃芪甲苷40 mg/kg，人參皂苷Rg150 mg/kg，人參皂苷Rb140 mg/kg，三七皂苷R110 mg/kg。

黃芪甲苷；人參皂苷Rg1；人參皂苷Rb1；三七皂苷R1；配伍；腦缺血再灌注；氧化應(yīng)激；能量代謝

缺血性腦損傷的病理過程極為復(fù)雜，其發(fā)病機制與腦組織能量代謝障礙、興奮毒性、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等有關(guān)[1]。中醫(yī)藥理論認為，缺血性腦損傷的基本病理機制多為氣虛血滯、脈絡(luò)瘀阻，因此，常采用益氣活血法治療[2]。研究表明，黃芪和三七具有抗腦缺血的作用，二者配伍可增強其抗缺血性腦損傷的作用。黃芪中的主要有效成分是黃芪總皂苷（Astragalosides，AST），主要含黃芪甲苷等活性成分；三七中的主要有效成分是三七總皂苷（Panax notoginseng saponins，PNS），主要含人參皂苷Rg1、Rb1和三七皂苷R1等活性成分。我們以往的研究表明，AST和PNS配伍具有增強其抗腦缺血的作用[3-5]。因此，我們認為，中藥有效組分配伍協(xié)同增效的作用是其有效成分合理配伍作用的結(jié)果[6]，AST和PNS配伍增強抗腦缺血作用是其有效成分配伍所致。為進一步明確黃芪和三七配伍增強抗腦缺血作用的機制，本研究對其主要的有效成分進行了配伍關(guān)系的研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 SPF級C57BL/6雄性小鼠，體質(zhì)量為22～28 g，由湖南中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，許可證號：SCXK（湘）2009-0004。飼養(yǎng)于室溫25℃，濕度55%的環(huán)境。

1.1.2 藥物 黃芪甲苷 （批號：MUST-09102301）、人參皂苷Rg1（批號：MUST-11041201）、人參皂苷Rb1（批號：MUST-11042801）、三七皂苷R1（批號MUST-11041201），純度均≥98%，均由成都曼思特生物科技有限公司提供，用時溶于5%羧甲基纖維素鈉溶液中。

1.1.3 試劑與儀器 脂質(zhì)過氧化物丙二醛（MDA）含量測定試劑盒（批號：20120222）、谷胱甘肽（GSH）含量測定試劑盒（批號：20120220）、超氧化物歧化酶（SOD）活性測定試劑盒（批號：20120218）、考馬斯亮藍化學比色法總蛋白含量測定試劑盒 （批號：20111212），均購于南京建成生物工程研究所。ATP標準品為Sigma公司產(chǎn)品，其他試劑為國產(chǎn)分析純。液相色譜儀（Agilent 1200 series），液相色譜柱（Hypersil，ODS2，5μm，250 mm×4.6 mm）。

1.2 方法

1.2.1 分組和給藥方法 前期實驗表明[3]，PNS和AST抗腦缺血的有效配伍劑量為AST 110 mg/kg+ PNS 115 mg/kg。換算成各有效成分的劑量為：黃芪甲苷41.8 mg/kg，人參皂苷Rg158 mg/kg，人參皂苷Rb135.5 mg/kg，三七皂苷R114.4 mg/kg。以本劑量為依據(jù)，分別設(shè)立高、中、低劑量水平，采用L9（34）正交試驗，共組成9個配伍組合（見表1）。另設(shè)假手術(shù)對照組（即試驗組0，予0.5%的羧甲基纖維素鈉溶液），共10組，按0.1 mL/10 g灌胃給藥，每日1次，連續(xù)給藥3 d，于末次給藥1 h后造模，術(shù)前禁食12 h。按文獻方法制備腦缺血再灌注模型[7]。將小鼠以無水乙醚吸入麻醉后仰臥位固定，在頸部正中做1 cm垂直切口，分離頸總動脈及伴行的迷走神經(jīng)，夾閉雙側(cè)頸總動脈，造成腦缺血，20 min后恢復(fù)血流，再灌注30 min后斷頭取腦，去除小腦和腦干，做相應(yīng)指標檢測。假手術(shù)組也進行同樣手術(shù)，但不行腦缺血再灌注，其他操作與以上各組相同。

表1 L9(34)篩選4種有效成分配伍給藥劑量表（mg/kg，n=4）

1.2.2 氧化應(yīng)激指標的測定 取左腦皮質(zhì)約120 mg，按質(zhì)量/體積1∶9以0.01 mol、pH 7.4的磷酸鹽緩沖液制成10%組織勻漿液，4℃離心5 min（2 500 r/min），取上清液按試劑盒說明測定MDA、 GSH、SOD。

1.2.3 腦組織 ATP的測定 取右腦皮質(zhì)約120 mg，按質(zhì)量/體積1∶9以5%的冷高氯酸制成10%組織勻漿液，4℃離心15 min（15 000 r/min），取上清液約0.8 mL，加入 3 mol/L的 K2CO3約0.12 mL，調(diào)pH至中性，4℃離心5 min（3 000 r/min），取上清液以高效液相色譜（HPLC）測定ATP含量。HPLC測定條件：ODS-18液相色譜柱；流動相為 K2HPO4（A）-KH2PO4（B），梯度洗脫：0～12 min，86.8%B，12～22 min，85.5%B，22～38 min，86.8%B；柱溫25℃；檢測波長：254 nm；流速：0.7 mL/min；進樣量：10 μL。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 各組氧化應(yīng)激指標和ATP的比較

與假手術(shù)組比較，模型組腦組織ATP、GSH含量顯著降低，MDA含量顯著增加，而SOD活性降低（均P<0.01）；與模型組比較，各配伍組均能不同程度地升高ATP、GSH含量（P<0.05或P<0.01），降低MDA含量（P<0.01），使SOD活性升高（P<0.05或P< 0.01）。見表2。

表2 各組氧化應(yīng)激指標和ATP的比較 （±s，n=4）

表2 各組氧化應(yīng)激指標和ATP的比較 （±s，n=4）

注：vs.假手術(shù)組（試驗組0）△P<0.05，△△P<0.01；vs.模型組（試驗組1）★P<0.05，★★P<0.01。

試驗組別0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 ATP（μg/g組織）503.60±48.57 285.16±44.79△△428.23±26.95★★394.28±21.82★★398.95±12.77★★249.69±7.86 504.84±34.47★★679.77±22.01★★329.05±8.38★464.87±28.13★★SOD（U/mg蛋白）65.41±1.71 38.97±1.68△△45.26±1.27★★44.51±3.13★★45.07±3.71★★58.02±2.43★★40.73±3.12 46.22±2.27★★59.78±2.03★★43.69±2.50★MDA (nmol/mg蛋白) 75.64±2.77 115.63±3.28△△97.74±2.20★★74.64±2.76★★78.38±1.25★★79.88±2.38★★62.54±1.72★★108.58±5.88★★119.32±2.22 105.70±1.50★★GSH（mg/g蛋白）3.40±0.40 1.17±0.37△△1.70±0.25★2.38±0.52★★2.32±0.28★★3.23±0.43★★1.39±0.30 2.31±0.23★★2.07±0.32★★3.24±0.40★★

2.2 各指標的正交試驗分析

ATP應(yīng)當以含量高為好，故在本實驗條件下，配伍劑量應(yīng)以 A3B3C3D2為最佳方案，即黃芪甲苷40 mg/kg，人參皂苷Rg150 mg/kg，人參皂苷Rb140 mg/kg，三七皂苷R110 mg/kg。

SOD應(yīng)當以活性高為好，故在本實驗條件下，配伍劑量應(yīng)以A3B2C3D3為最佳方案，即黃芪甲苷40 mg/kg，人參皂苷Rg125 mg/kg，人參皂苷Rb140 mg/kg，三七皂苷R120 mg/kg。

MDA應(yīng)當以含量低為好，故在本實驗條件下，配伍劑量應(yīng)以A2B3C3D2為最佳方案，即黃芪甲苷20 mg/kg，人參皂苷Rg150 mg/kg，人參皂苷Rb140 mg/kg，三七皂苷R110 mg/kg。

GSH應(yīng)當以含量高為好，故在本實驗條件下，配伍劑量應(yīng)以A3B3C3D1為最佳方案，即黃芪甲苷40 mg/kg，人參皂苷Rg150 mg/kg，人參皂苷Rb140 mg/kg，三七皂苷R10 mg/kg。見表3-6。

2.3 正交試驗的綜合分析

由于氧化應(yīng)激指標和能量代謝指標在缺血性腦損傷中的重要性不一樣，故對各指標賦予不同權(quán)重系數(shù)：ATP為0.3，SOD為0.25，MDA為0.25（由于要求MDA值越小越好，故在計算MDA的權(quán)重計分時，將MDA結(jié)果取倒數(shù)再乘以權(quán)重系數(shù)），GSH為0.2，則綜合評分（Y）=0.3ATP+0.25SOD+0.25/MDA+ 0.2GSH，對綜合評分進行正交試驗的方差分析，結(jié)果見表7。

綜合計分分析表明：4種有效成分配伍時，各成分不同水平之間均有顯著性差異（P<0.01）。綜合計分以得分值高為好，故配伍劑量應(yīng)以A3B3C3D2為最佳方案，即黃芪甲苷 40 mg/kg，人參皂苷 Rg150 mg/kg，人參皂苷Rb140 mg/kg，三七皂苷R110 mg/kg。

3 討論

中藥是通過多成分、多靶點發(fā)揮作用的。中藥有效組分的總體效應(yīng)不能用每一成分單獨作用的線性疊加來表示，而是其中的有效成分綜合作用的結(jié)果。因此，根據(jù)中醫(yī)藥理論和現(xiàn)代中藥研究成果，將中藥有效成分合理配伍將可能發(fā)揮增強療效、減少毒副反應(yīng)的作用，使藥物配伍組方實現(xiàn)定量化[8]。以往我們基于方劑配伍理論和藥理機制，對黃芪和三七的有效組分配伍抗腦缺血作用進行了研究，這為進一步開展三七和黃芪的有效成分配伍研究，創(chuàng)制成分清楚、機制明確、效應(yīng)增強的中藥有效成分配伍組方奠定了實驗依據(jù)。

表3 ATP正交試驗的方差分析 （μg/g組織，n=4）

表4 SOD正交試驗的方差分析 （U/mg蛋白，n=4）

表5 MDA正交試驗的方差分析 （nmoL/mg蛋白，n=4）

表6 GSH正交試驗的方差分析 （mg/g蛋白，n=4）

表7 賦予各指標不同權(quán)重后的綜合計分的方差分析 （n=4）

腦缺血后病理變化十分復(fù)雜，主要病理生理機制有能量代謝障礙，自由基、一氧化氮（NO）和興奮性氨基酸（EAA）的神經(jīng)毒作用，血腦屏障（BBB）破壞等[8-11]。腦缺血后，腦組織的主要化學能量ATP急劇減少，高能磷酸化合物生成減少，造成腦組織能量代謝障礙。同時產(chǎn)生大量的超氧陰離子和羥自由基，與細胞膜上脂質(zhì)發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，使GSH含量減少，SOD活性降低，以及MDA含量增加，破壞膜功能和線粒體的呼吸功能，進一步使能量生成障礙。我們根據(jù)以往的研究成果，采用正交試驗方法，對黃芪和三七苷類有效組分的四種主要有效成分進行了抗腦缺血的有效配伍研究。結(jié)果表明，黃芪甲苷、人參皂苷Rg1、Rb1和三七皂苷R1配伍能增加腦組織中ATP、GSH含量和SOD活性，減少MDA的生成，對抗腦缺血再灌注損傷。提示黃芪和三七配伍抗腦缺血的作用是來自于其中有效成分合理配伍的結(jié)果，不同的有效成分可能作用于不同的靶點，從而發(fā)揮對腦缺血的綜合防治作用。綜合評價其抗氧化應(yīng)激損傷和增強能量代謝的效應(yīng)，我們得出：黃芪甲苷、人參皂苷Rg1、Rb1和三七皂苷R1的有效配伍劑量為：黃芪甲苷40 mg/kg，人參皂苷Rg150 mg/kg，人參皂苷Rb140 mg/kg，三七皂苷R110 mg/kg。這為進一步合理利用黃芪和三七的有效成分開發(fā)有效的抗腦缺血中藥有效成分配伍復(fù)方奠定了基礎(chǔ)。

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（本文編輯 楊 瑛）

The Combination Study of Astragaloside IV,Ginsenosides Rg1,Rb1and Notoginsenoside R1on Antagonizing Oxidative Stress Injury and Promoting Energy Metabolism after Ischemia-reperfusion in Mice

HUANG Xiaoping,WANG Bei,QIU Yongyuan,ZENG Rong,DENG Changqing,TANG Yinghong*
(Molecular Pathology Laboratory of Hunan University of Chinese Medicine,Key Laboratory of Hunan Province for Prevention and Treatment of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine on Cardio-cerebral Diseases,Key Laboratory of Hunan Universities for Cell biology and Molecular techniques,Changsha,Hunan 410208,China)

astragaloside IV; ginsenoside Rg1; ginsenoside Rb1; notoginsenoside R1;combination;cerebral ischemia-reperfusion;oxidative stress;energy metabolism

R743.31，R285.5

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2014.07.002.005.07

2013－03－24

國家自然科學基金資助項目(81102557)；教育部2010年度高等學校博士學科點專項科研基金資助項目(20104323110001)；湖南省高校創(chuàng)新平臺開放基金資助項目(11K050)；湖南省教育廳一般項目(11C0963)；湖南省中醫(yī)藥管理局重點項目（201301）；湖南省科技廳一般項目（2014SK3001）。

黃小平，女，副教授，主要研究方向為心腦血管疾病的防治研究。

*唐映紅，女，碩士研究生導師，教授，E-mail：dchangq@sohu.com。

〔Abstract〕Objective To study the combination relativity among Astragaloside IV, Ginsenoside Rg1,Rb1and Notoginsenoside R1againstischemia-reperfusion injury through oxidative stress and energy metabolism,expliciting the effective combination dose.Methods Using L9(34)orthogonal experimental method,C57BL/6 mice were randomly grouped,treated for 3 d.At 1 h after the last administration,bilateral common carotid artery (CCA)were occluded with artery clip for 20 min followed by reperfusion for 30 min,to detect the contents of adenosine triphosphate (ATP),glutathione (GSH),malondialdehyde (MDA)and the activity of superoxide dismutase(SOD)in brain tissues.Results Astragaloside IV,ginsenosides Rb1,Rg1and notoginsenoside R1increased the contents of GSH,ATP and the activity of SOD,decreased MDA content,having inhibitory effect on oxidative stress injury after cerebral ischemia-reperfusion and improving energy metabolism ofbrain tissues.Fouractive components combination potentiated the effect against cerebral ischemia-reperfusion injury. Conclusion The effective combination dose of four active component antagonizing oxidative stress injury and improving energy metabolism after ischemia-reperfusion in mice was Astragaloside IV 40 mg/kg,ginsenosides Rg150 mg/kg,ginsenosides Rb140 mg/kg,notoginsenoside R110 mg/kg, respectively.